B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白對MDR1基因反式激活能力的比較

1、B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白對MDR1基因反式激活能力的比較         【摘要】  目的研究B、C基因型乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白對多藥耐藥基因1(MDR1)反式激活能力的差別。方法PCR擴增B、C基因型HBV X基因并克隆于pcDNA3.1/HisC載體(重組載體分別為pcDNA3.1/HisCXB及pcDNA3.1/HisCXC)。以FuGENE6將重組表達載體轉(zhuǎn)染HepG2細胞,采用融合表達的Xpress多肽表位抗體,通過Western blot檢測目的蛋白在不同時間段的表達。PCR擴增M

2、DR1基因啟動子并克隆于螢火蟲熒光素酶報告載體pGL3Basic(重組載體為pGLMDR)。pGLMDR分別與pcDNA3.1/HisCXB或pcDNA3.1/HisCXC共轉(zhuǎn)染HepG2細胞,轉(zhuǎn)染后48 h裂解細胞并檢測胞內(nèi)螢火蟲熒光素酶活性。實驗數(shù)據(jù)以SPSS 11.5軟件分析。結(jié)果成功克隆X蛋白表達載體及MDR1報告載體。Western blot顯示pcDNA3.1/HisCXB或pcDNA3.1/HisCXC在HepG2細胞中均能表達HBV X蛋白,以轉(zhuǎn)染后48 h為最高。當pGLMDR報告質(zhì)粒與X基因重組載體或空載體質(zhì)量比在1214范圍內(nèi),螢火蟲熒光素酶在各轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)的活性依次為pc

3、DNA3.1/HisCXB+pGLMDR組pcDNA3.1/HisCXC+pGLMDR組pcDNA3.1/HisC+pGLMDR組(對照組),且存在劑量效應關系。結(jié)論B、C基因型HBV X蛋白對多藥耐藥基因均有反式激活能力,且B基因型強于C基因型。 【關鍵詞】  肝炎病毒 乙型 癌 肝細胞 基因 病毒 反式激活（遺傳學） 病毒蛋白質(zhì)類 基因 MDR 藥物耐受性   X蛋白是乙型肝炎病毒(HBV)最重要的致病因子之一,可反式激活多藥耐藥基因1(multidrug resisitance gene 1,MDR1)1,與HBV相關性原發(fā)性肝細胞癌(primary hep

4、atocellular carcinoma,HCC)的高度惡性化及對化療藥物高度不敏感有關。研究表明B、C基因型HBV相關性HCC患者的臨床表現(xiàn)及病理改變具有明顯差別,而B、C基因型HBV X蛋白功能存在差異24。本研究擬通過分析B、C基因型HBV X蛋白對MDR1基因反式激活能力的差異,進一步探討HBV基因型與致病性的相互關系。   1材料和方法   1.1.1HBV DNA及肝細胞株pUC18XB(含B基因型HBV X基因的pUC18重組載體)及pUC18XC(含C基因型HBV X基因的pUC18重組載體)為本室保存。HepG2肝癌細胞株(美國組織細

5、胞庫,ATCC)。   1.1.2主要試劑DMEM培養(yǎng)基、DNAzol、胎牛血清、Westernbreeze試劑盒、Anti Xpress抗體、pcDNA3.1/HisC(美國Invitrogen公司);Expand High Fidelity PCR Kit、FuGENE6(美國Roche公司);phRLSV40,pGL3basic(美國Promega公司);質(zhì)粒大量抽提試劑盒(美國Qiagen公司);Braford蛋白檢測試劑盒(美國BioRad公司)。硝酸纖維素膜(美國Amersham公司)。   1.2.1HBV X基因表達載體構(gòu)建PCR擴增目的

6、片段,所用引物為:   上游(B基因)XbF:5CGGGGTACCCAGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAAC 3(下劃線為KpnI位點)   上游(C基因)XcF:5CGGGGTACCCAGCTGCTCGG   GTGTGCTGCCAAC 3(下劃線為KpnI位點)   下游XbcR:5GCTCTAGATTAGGCAGAGGTGAA   AAAGTTGC 3(下劃線為XbaI位點)   以pUC18XB為模板,引物XbF及XbcR用于擴增B基因型HBx(XB),以pUC

7、18XC為模板,引物XcF及XbcR用于擴增C基因型HBx(XC)。擴增片段以XbaI及KpnI位點克隆于表達載體pcDNA3.1/HisC,經(jīng)基因測序證實無誤,所得克隆分別命名為pcDNA3.1/HisCXB(含B基因型HBx)和pcDNA3.1/HisCXC(含C基因型HBx)。   1.2.2MDR1基因啟動子報告載體構(gòu)建以DNAzol抽提HepG2細胞染色體DNA,取0.2 g作為模板進行目的DNA擴增,引物設計根據(jù)參考文獻1,序列為:   上游MDRB:5CGAGCTCATCCTGCACTGTTTAGGGAGGGTT 3(下劃線為SacI位點)

8、   下游MDRP3:5CTAGCTAGCTTTGAGCTTGGAAGAGCCGCTACT 3(下劃線為NheI位點)   以SacI、NheI位點克隆于pGL3Basic。重組載體以雙酶切鑒定并經(jīng)測序證實目的基因正確無誤。獲得的重組載體命名為pGLMDR。   1.2.3HBV X蛋白檢測Qiagen試劑盒抽提pcDNA3.1/HisCXB、pcDNA3.1/HisCXC、pcDNA3.1/HisC、pGL3Basic及pGLMDR。HepG2細胞以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng),采用FuGENE 6轉(zhuǎn)染,簡要程序為:轉(zhuǎn)染前24 h

9、按6×105/60 mm平皿接種細胞;每個平皿DNA轉(zhuǎn)染量為6.6 g,FuGENE 6用量為10 L;分別在轉(zhuǎn)染后24,48,72及96 h各收取一平皿細胞。抽提蛋白并以Westernblot檢測剪接特異性蛋白,簡要程序如下:細胞經(jīng)PBS洗滌3次后以RIPA裂解液(50 mmol/L Tris pH 7.2,150 mmol/L NaCl,0.1%SDS,0.5%DOC,1%NP40,2 mmol/L EDTA,50 mmol/L NaF)裂解細胞,離心獲得上清。Bradford法(BioRad)測定蛋白量,取等量蛋白30 g,經(jīng)15%SDSPAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。

10、Westernblot檢測采用的一抗為與目的蛋白融合表達的標簽抗體,即Anti Xpress抗體(14000),二抗、封閉液、洗液及檢測系統(tǒng)采用Westernbreeze試劑盒。操作按試劑說明書。   1.2.4質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染分3組,分別為pcDNA3.1/HisCXB+pGLMDR、pcDNA3.1/HisCXC+pGLMDR、pcDNA3.1/HisC+pGLMDR。pGLMDR與X基因重組載體或空載體的質(zhì)量比例分別為11，12，13，14及15,各組均以海腎熒光素酶表達載體phRLSV40作為內(nèi)參照以平衡轉(zhuǎn)染效率。報告質(zhì)粒pGLMDR另外做1份單獨轉(zhuǎn)染,作為啟動

11、子背景,用于相對熒光素酶活性的計算。以報告質(zhì)粒pGLMDR單獨轉(zhuǎn)染所測得熒光值,作為啟動子背景,記為1,其余檢測值與啟動子單獨轉(zhuǎn)染的熒光值相除,得到1個相對熒光素酶活性值。實驗重復5次。   1.2.5熒光素酶活性檢測DNA共轉(zhuǎn)染48 h后,用預冷的PBS洗滌細胞2次,徹底吸棄殘留的PBS,以1×Passive Lysis Buffer裂解液(美國Promega公司)500 L裂解細胞,先檢測胞內(nèi)蛋白量,后各取等量蛋白100 g用于海腎熒光素酶及螢火蟲熒光素酶活性檢測,操作步驟按試劑說明書。以海腎熒光素酶活性平衡校正螢火蟲熒光素酶值。實驗重復5次。 &#

12、160; 1.3統(tǒng)計學處理使用SPSS 11.5軟件包處理所得數(shù)據(jù)。   2結(jié)果   2.1重組載體構(gòu)建PCR擴增獲得長度約465 bp的B、C基因型HBV X基因(分別為XB及XC),并克隆于表達載體pcDNA3.1/HisC。重組載體經(jīng)XbaI及KpnI雙酶切鑒定及基因測序證實無誤,所得克隆分別命名為pcDNA3.1/HisCXB和pcDNA3.1/HisCXC。PCR擴增獲得長度約1 700 bp的MDR1基因啟動子(+29-1 730 bp),并克隆于熒火蟲熒光素酶報告載體pGL3Basic。重組載體以SacI及NheI雙酶切鑒定(圖1)并經(jīng)測序

13、證實目的基因正確無誤。獲得的重組載體命名為pGLMDR。            1:XB擴增產(chǎn)物; 2:XC擴增產(chǎn)物; 35:分別為pcDNA3.1/HisC、pcDNA3.1/HisCXB及pcDNA3.1/HisCXC以XbaI+KpnI雙酶切; 6:MDR1基因啟動子擴增產(chǎn)物; 7,8:分別為pGL3Basic及pGLMDR以SacI+NheI雙酶切; M:分子量標準.   2.2HBV X蛋白在HepG2細胞中表達X蛋白含154個氨基酸,相對分子質(zhì)量約18 kD。在重

14、組表達載體中,X蛋白與載體編碼的40氨基酸多肽(其中含Xpress表位)融合表達,融合蛋白的相對分子質(zhì)量約23 kD。以抗Xpress抗體進行的Western blot檢測結(jié)果顯示，pcDNA3.1/HisCXB或pcDNA3.1/HisCXC轉(zhuǎn)染HepG2細胞24 h后可見目的蛋白表達,48 h達到最高,轉(zhuǎn)染后96 h表達下降,此外,相同時間段XB及XC的表達強度無差別(XB表達檢測,圖2)。   1:24 h; 2:48 h; 3:72 h; 4:96 h. pcDNA3.1/HisCXB轉(zhuǎn)染HepG2細胞轉(zhuǎn)染后裂解細胞.   圖2Western b

15、lot檢測HBV X蛋白在HepG2細胞中表達   Fig 2Western blot analysis of HBV X protein expressed in HepG2 cells   2.3B、C基因型HBV X蛋白對MDR1基因的反式激活能力不同pcDNA3.1/HisCXB或pcDNA3.1/HisCXC分別與報告質(zhì)粒pGLMDR共轉(zhuǎn)染HepG2細胞,通過檢測胞內(nèi)熒火蟲熒光素酶活性的高低,評價HBV X蛋白對MDR1基因的反式激活能力高低。由于Western blot結(jié)果顯示X蛋白在轉(zhuǎn)染后48 h表達量最高(圖2),故選擇該時間點裂解細胞并

16、檢測胞內(nèi)熒光素酶活性，檢測結(jié)果見表1及圖3,配對t檢驗顯示,對于1214相同比例   的pGLMDR報告質(zhì)粒與X基因重組載體或空載體,胞內(nèi)熒火蟲熒光素酶活性大小依次為pcDNA3.1/HisCXB+pGLMDR組pcDNA3.1/HisCXC+pGLMDR組pcDNA3.1/HisC+pGLMDR組(對照組)(n=5,P0.01),且存在明顯的劑量效應關系;當二者比例為11和15時(圖3),pcDNA3.1/HisCXB+pGLMDR組與pcDNA3.1/HisCXC+pGLMDR組相同(n=5,P0.05),但均高于pcDNA3.1/HisC+pGLMDR組(n=5,P0

17、.01)。表1轉(zhuǎn)染的HepG2細胞內(nèi)相對螢火蟲熒光素酶活性與pGLMDR+pcDNA3.1/HisCXB比較，#：P0.01.   3討論   HCC的臨床特征是高度惡性化及對化療藥物高度不敏感,這與肝細胞過度表達MDR1基因有關。MDR1基因編碼產(chǎn)物Pgp170(P170糖蛋白)可將親脂類化療藥泵出胞外而導致細胞耐藥。它由一種藥物誘發(fā),而同時對其它多種結(jié)構(gòu)和作用機制完全不同的抗癌藥物產(chǎn)生交叉耐藥1。   X蛋白是HBV最重要的致病因子之一,與HBV相關性HCC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移關系密切。HBV X蛋白可反式激活MDR1基因1,

18、導致HCC高度惡性化及對化療藥物高度不敏感。筆者先前的研究表明HBV X蛋白的結(jié)構(gòu)及對CMV啟動子的反式激活能力具有B、C基因型特異性差異4,6,本研究旨進一步探討B(tài)、C基因型HBV X蛋白功能差異。轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示,B、C基因型HBV X蛋白對MDR1基因啟動子均有反式激活作用,且B基因型X蛋白要強于C基因型。   HBV共有8個基因型(分別為AH)。B、C基因型HBV相關性HCC的臨床表現(xiàn)及病理改變存在差異23:B基因型與50歲以下人群的HCC相關性更大,而C基因型引起的HCC在老年人中較多,上述差異的確切機制不明。由于MDR1基因的過表達除涉及到耐藥外,也是癌細胞生物學行

19、為進一步惡性化的指標。本研究提示，B、C基因型HBV X蛋白對MDR1基因反式激活能力的差別可能是造成上述差異的原因之一。   需要指出的是,本研究只初步證實了B、C基因型HBV X蛋白對MDR1基因反式激活能力存在差異,造成這種差別的原因尚不清楚,筆者正采用基因置換及定點突變研究其確切機制。另外,目前尚未有HBV基因型與HCC耐藥相互關系的報道,因此,B、C基因型HBV X蛋白對MDR1基因反式激活能力差別的臨床意義有待進一步評價。【參考文獻】  “1“Doong S L,Lin M H,Tsai M M,et al. Transactivation of th

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