黃芪對(duì)腹膜透析效能及腹膜間皮細(xì)胞與腹腔免疫功能的影響江蘇申報(bào)

1、登記序號(hào)： 計(jì)劃類別： 分類代碼： 項(xiàng)目編號(hào)： 科技項(xiàng)目計(jì)劃設(shè)計(jì)任務(wù)書(shū) 項(xiàng)目名稱：黃芪對(duì)腹膜透析效能及腹膜間皮細(xì)胞與腹腔免 疫功能的影響 承擔(dān)單位： 單位地址： 郵編： 項(xiàng)目負(fù)責(zé)人： 電話： 職務(wù)職稱： 主管部門： 南京市衛(wèi)生局 填報(bào)日期： 2002年04月26日 江蘇省科學(xué)技術(shù)廳二OO一年制一、立項(xiàng)依據(jù)：1、國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢(shì)及理論實(shí)踐依據(jù)： 隨著腹膜透析（Peritoneal Dialysis，PD）技術(shù)的不斷提高和透析理論的日趨完善，尤其是1976年P(guān)opovich提出的連續(xù)非臥床腹膜透析（Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis，CAPD

2、）治療方法帶來(lái)了腹膜透析的空前繁榮。近年來(lái)的流行病學(xué)資料表明接受腹膜透析治療的終末期腎功能不全（End-Stage Renal Disease，ESRD）患者正以每年7.5%的比例迅速增長(zhǎng)，目前全球已有超過(guò)120000的患者在接受腹膜透析治療。腹膜透析因其相對(duì)于血液透析更高的生活質(zhì)量、顯著的殘余腎功能保護(hù)、優(yōu)于或等于血液透析的生存率以及較少的資金花費(fèi)，故有作者提出，腹膜透析應(yīng)該是腎臟替代療法的首選1,2。 然而，隨著腹膜透析患者壽命的延長(zhǎng)，腹膜透析的遠(yuǎn)期并發(fā)癥腹膜功能衰竭已成為ESRD患者透析技術(shù)性失敗的最重要的原因3，并成為制約腹膜透析發(fā)展的“瓶頸”。 資料顯示約1/3的腹膜透析患者6年后因

3、腹膜功能衰竭而退出透析治療。腹膜功能衰竭與長(zhǎng)期腹膜透析后腹膜結(jié)構(gòu)和功能破壞進(jìn)而導(dǎo)致腹膜超濾失敗以及溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙密切相關(guān)4。腹膜透析液的生物不相容性是導(dǎo)致腹膜功能衰竭的首要原因，腹膜間皮細(xì)胞作為腹膜組成部分在這一過(guò)程中扮演著重要角色。近年來(lái)隨著人腹膜間皮細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法和腹膜透析動(dòng)物模型的確立，腹膜功能衰竭的機(jī)理得以初步闡明。腹膜間皮細(xì)胞在長(zhǎng)期非生理性透析液刺激下，轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子（TGF-）mRNA過(guò)度表達(dá)，TGF-作為細(xì)胞增殖與細(xì)胞外基質(zhì)合成的重要調(diào)節(jié)因子，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成增加和腹膜纖維化5，最終導(dǎo)致腹膜超濾失敗和溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙。同時(shí)TGF-也是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞因子，組織病理學(xué)證實(shí)

4、腹膜功能衰竭的重要特征表現(xiàn)為腹膜間皮細(xì)胞的喪失，過(guò)多的TGF-表達(dá)將增加間皮細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致間皮細(xì)胞的完整性受到破壞，研究表明完整的間皮細(xì)胞層可以顯著延緩腹膜纖維化的進(jìn)程。其次，腹膜透析的主要并發(fā)癥腹膜感染也是導(dǎo)致腹膜功能衰竭的重要原因,反復(fù)的炎癥刺激使腹膜局部高水平TGF-持續(xù)存在致使腹膜發(fā)生纖維化和硬化6。目前公認(rèn)長(zhǎng)期腹膜透析時(shí)腹腔細(xì)胞免疫功能抑制是導(dǎo)致腹膜反復(fù)感染的主要原因,尤其是被認(rèn)為是腹腔細(xì)胞免疫功能最重要組成部分和腹膜抵抗細(xì)菌感染第一道屏障的巨噬細(xì)胞功能的明顯抑制。研究表明，腹膜在長(zhǎng)期非生理性透析液的刺激下，巨噬細(xì)胞功能受到抑制，當(dāng)腹膜發(fā)生感染時(shí)透析患者腹腔巨噬細(xì)胞功能指標(biāo)包括吞噬

5、指數(shù)、白細(xì)胞介素1（IL-1）和腫瘤壞死因子（TNF-）水平顯著降低，如果改用更符合生理?xiàng)l件的透析液則可以使腹腔巨噬細(xì)胞功能得到明顯增強(qiáng)，從而增強(qiáng)腹膜對(duì)感染的抵抗能力，減少腹膜炎的發(fā)生7。最近，腹膜血管在腹膜功能衰竭中的作用也得到重視，充足的血流除了能有效增強(qiáng)腹膜的抵抗力減少腹膜炎的發(fā)生外8，也是維持長(zhǎng)期腹膜透析患者腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能的重要因素。腹膜血管血流量減少時(shí)腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和腹膜超濾率均顯著下降9，研究顯示長(zhǎng)期腹膜透析患者腹膜血管內(nèi)皮細(xì)胞依賴的血管舒張因子顯著減少，從而影響腹膜透析的效能，而如在腹膜透析液中添加擴(kuò)血管物質(zhì)硝普納則能有效提高腹膜透析患者的透析效果。 基于上述研究結(jié)果，近年來(lái)臨床醫(yī)師

6、一直致力于兩方面的研究。一是研究更符合生理?xiàng)l件以及不影響腹膜免疫功能的全新的腹膜透析液。雖然已有諸如含多聚糖、含氨基酸、含碳酸氫根等多種透析液的體外實(shí)驗(yàn)的報(bào)道，但事實(shí)上所有這些透析液并不能完全替代葡萄糖作為滲透性物質(zhì)的作用，其臨床應(yīng)用前景尚不明確。另一方面，腎臟病醫(yī)師通過(guò)在現(xiàn)有的透析液中添加一些物質(zhì)來(lái)達(dá)到保護(hù)和改善腹膜功能的目的。有研究表明在透析液中加入雙嘧莫達(dá)能顯著降低小鼠腹透液中TGF-的含量，而加入透明質(zhì)酸可以在保護(hù)腹膜間皮細(xì)胞方面起到一定的效果。中藥黃芪是一種含有多糖、甙、黃酮和微量元素等多種成分的物質(zhì)，其具有多重藥理作用10。黃芪能顯著抑制炎癥因子TGF-的表達(dá)，從而延緩肝臟、腎臟等

7、多種臟器疾病時(shí)發(fā)生纖維化的進(jìn)程；能明顯減緩人胚二倍體細(xì)胞自然衰老過(guò)程延長(zhǎng)細(xì)胞壽命約1/3左右11；能有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能，通過(guò)向小鼠腹腔注射黃芪可以發(fā)現(xiàn)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能得到增強(qiáng)，從而增強(qiáng)腹膜抗菌能力；黃芪還具有擴(kuò)血管的作用，研究顯示其能顯著抑制血管收縮物質(zhì)內(nèi)皮素的釋放，從而可能起到擴(kuò)張血管增加血流量的作用12。根據(jù)黃芪的上述作用，可以推測(cè)，在腹膜透析液中加入黃芪可以起到延長(zhǎng)腹膜間皮細(xì)胞的壽命、抑制間皮細(xì)胞TGF-的分泌、提高腹腔巨噬細(xì)胞功能、改善局部微循環(huán)，從而阻止/延緩腹膜纖維化和防止腹膜感染的發(fā)生，達(dá)到阻止/延緩腹膜功能衰竭的目的。然而關(guān)于黃芪在腹膜透析中的應(yīng)用尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。 主要參

8、考文獻(xiàn)：1. Thodis E, Passadakis P, Vargemezis V, Oreopoulos DG.Peritoneal dialysis: better than, equal to, or worse than hemodialysis? Data worth knowing before choosing a dialysis modality. Perit Dial Int ,2001; 21:25-35.2. Van Biesen W, Vanholder R, Lameire N.The Role of Peritoneal Dialysis as the Fir

9、st-Line Renal Replacement Modality.Perit Dial Int , 2000;20: 375 - 383 3. An S. De Vriese, Siska Mortier, Norbert H,et al.What happens to the peritoneal membrane in long-term peritoneal dialysis? Perit Dial Int, 2001;Vol. 21 ;:S9-284Devuyst O,Topley N,Williams JD.Morphological and functional changes

10、 in the dialysed peritoneal cavity:impact of more biocompatible solutions.Nephrol Dial Transplant,2002;17(3):12-55.Blobe GC,Schiemann WP,Lodish HF.The role of transforeing growth factor beta in human disease.N ENGL J Med ,2000;342:1350-86Lin CY,Chen WP,Yang LY,et al.Persistent transforming growth fa

11、ctor-betal 1 expression may ptedict peritoneal fibrosis in CAPD patients with frequent peritonitis ocurrence.Am J Nephrol,1998;18:513-97.Jones S,Holmes CJ,Mackenzie RK,etal.Continuous dialysis with bicarbonate/lactate-buffered peritoneal dialysis fluids in a long-term improvement in ex vivo peritone

12、al macrophage function.J A Soc Nephrol,2002;13:S97-1038Park MS.Factors increasing severnity of peritonitis in long-term peritoneal dialysis patients.Adv Ren Replace Ther，1998；5：185-939.Ronco C,Brendolan A,Crepaldi C,et al.Ultrafiltration and clearence studies in human isolated pertoneal vascular loo

13、ps.Blood Purif,1994;12:233-4210.耿長(zhǎng)山。黃芪的免疫藥理研究進(jìn)展。中西醫(yī)結(jié)合雜志，1986；6：62-6411孟慶云。中國(guó)中醫(yī)藥發(fā)展50年。P28012伍敦裕，林海玲。黃芪注射液治療慢性腎功能不全患者血漿內(nèi)皮素變化及其意義。實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，1998；14：6112、研究目的與意義： 研究目的： 通過(guò)體外人腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)觀察中藥黃芪在抑制由高糖引起的TGF-過(guò)度表達(dá)中的作用，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從組織病理學(xué)角度觀察黃芪對(duì)腹膜間皮細(xì)胞完整性的維護(hù)和腹膜纖維化的抑制以及巨噬細(xì)胞功能調(diào)節(jié)等方面的作用，通過(guò)臨床觀察了解黃芪對(duì)腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能和免疫功能的影響，從不同層面了解黃芪在阻止/延

14、緩腹膜功能衰竭中的作用及其機(jī)制，為臨床上改善長(zhǎng)期腹膜透析患者透析療效提供一種新的治療方法。 研究意義： 隨著臨床腹膜透析的廣泛應(yīng)用以及腹膜透析患者壽命的延長(zhǎng)，臨床上因長(zhǎng)期腹膜透析導(dǎo)致腹膜功能衰竭進(jìn)而透析失敗的患者越來(lái)越多。中藥黃芪在我國(guó)分布廣泛且有2000多年的應(yīng)用歷史。目前臨床上已有黃芪注射液制劑，并且由于黃芪可以直接注入腹腔，因此通過(guò)從不同層面了解黃芪在阻止/延緩腹膜功能衰竭中的作用及其機(jī)制的研究，在臨床上推廣使用黃芪來(lái)阻止/延緩腹膜功能衰竭從而延長(zhǎng)ESRD患者腹膜透析時(shí)間、提高透析質(zhì)量、減少透析失敗率，提高腹膜透析遠(yuǎn)期療效具有廣泛的應(yīng)用前景。3、技術(shù)查新： 參見(jiàn)附頁(yè)。二、研究?jī)?nèi)容：研究?jī)?nèi)

15、容： 本課題采用體外細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、組織病理學(xué)與臨床相結(jié)合的系統(tǒng)研究方法，從多個(gè)方面研究中藥黃芪在防止/延緩腹膜功能衰竭中的作用，并從不同層面和角度解釋其作用機(jī)理。通過(guò)體外人腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)了解黃芪在抑制間皮細(xì)胞TGF-表達(dá)方面的作用；通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從組織病理學(xué)的角度直觀了解黃芪在間皮細(xì)胞保護(hù)以及在阻止/延緩腹膜纖維化中的作用；通過(guò)臨床應(yīng)用，了解黃芪對(duì)腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能以及免疫功能方面的影響。關(guān)鍵技術(shù)和技術(shù)難點(diǎn)：（1）體外人腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)方法的建立；（2）動(dòng)物腹膜透析模型及干預(yù)方法的建立； （3）TGF-、TNF-免疫組化檢測(cè)；（4）巨噬細(xì)胞吞噬功能的誘導(dǎo)及檢測(cè)；（5）標(biāo)準(zhǔn)腹膜透析腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)

16、功能改變的研究。課題的特色和創(chuàng)新之處：（1）腹膜功能衰竭是一多因素參與的病理過(guò)程，由于西藥作用較為單一，因此在如何有效阻止/延緩腹膜功能衰竭的研究中顯得較為局限，而中藥黃芪具有多重藥理作用，在阻止/延緩腹膜功能衰竭的研究中具有較大的優(yōu)勢(shì)。（2）由于部分藥物無(wú)法進(jìn)行腹腔內(nèi)應(yīng)用，因此以往的研究大多停留在體外試驗(yàn)的水平，而黃芪可以安全地應(yīng)用于腹腔內(nèi)注射，本課題的研究成果能夠直接應(yīng)用于臨床。（3）通過(guò)從體外細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、組織病理學(xué)以及臨床全面地對(duì)黃芪在阻止/延緩腹膜功能衰竭中的作用及機(jī)制進(jìn)行研究，至今尚未見(jiàn)類似的研究報(bào)道。主要技術(shù)指標(biāo)：（1）黃芪抑制間皮細(xì)胞TGF-分泌的指標(biāo)；（2）反映巨噬細(xì)胞

17、免疫功能的TNF-分泌水平以及吞噬功能的指標(biāo)；（3）黃芪對(duì)腹膜間皮細(xì)胞的維護(hù)和抑制纖維化的指標(biāo)；（3）黃芪對(duì)腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響。三、研究方法及技術(shù)路線：研究工作總體思路： 本研究首先通過(guò)人腹膜間皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法在培養(yǎng)基中添加黃芪觀察其抑制由高糖引起的間皮細(xì)胞TGF-過(guò)度表達(dá)中的作用，了解黃芪與腹膜間皮細(xì)胞TGF-表達(dá)之間的關(guān)系。然后通過(guò)腹膜透析動(dòng)物模型從組織病理學(xué)角度直觀了解黃芪對(duì)腹膜間皮細(xì)胞損傷的保護(hù)以及抑制腹膜纖維化方面的作用。最后通過(guò)在臨床上的應(yīng)用了解黃芪對(duì)腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能以及腹膜免疫功能的影響，并探討其作用機(jī)制。從而為臨床上阻止/延緩長(zhǎng)期腹膜透析患者因腹膜纖維化、腹膜反復(fù)感染導(dǎo)致的腹膜

18、功能衰竭提供新的治療方法。技術(shù)路線：（1）體外細(xì)胞培養(yǎng)部分： 從擇期手術(shù)小網(wǎng)膜切除的標(biāo)本獲得人網(wǎng)膜組織，按照文獻(xiàn)方法培養(yǎng)間皮細(xì)胞，通過(guò)調(diào)整原代（1-9代）人腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖濃度，在1.5%、4.5%葡萄糖條件下觀察添加與不添加黃芪對(duì)腹膜間皮細(xì)胞TGF-表達(dá)的影響，TGF-用免疫組化方法檢測(cè)。（2）動(dòng)物模型部分： 按照標(biāo)準(zhǔn)腹膜透析小鼠動(dòng)物模型建立方法建立小鼠腹膜透析模型，分別采用添加和不添加黃芪的葡萄糖濃度為1.5%、4.5%的透析液進(jìn)行腹膜透析，8周后取小鼠腹膜組織，10%甲醛溶液固定、脫水、 石蠟包埋后HE、PAS、PASM染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。（3）臨床部分：

19、在臨床上選擇長(zhǎng)期腹膜透析患者，采用自身對(duì)照的方法觀察添加黃芪前后患者腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能和患者透析液中TNF-濃度以及巨噬細(xì)胞吞噬功能的變化。（4）總結(jié)資料，分析結(jié)果。研究方法：（1）組織細(xì)胞培養(yǎng)方法。（2）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)學(xué)研究方法。（3）組織病理學(xué)方法。（4）生化分析方法。四、現(xiàn)有研究條件和工作基礎(chǔ)：1、現(xiàn)有工作基礎(chǔ)： -臨床上有大量的長(zhǎng)期腹膜透析的隨訪病人。研究者已成功掌握了人腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)方法和腹膜透析小鼠動(dòng)物模型建立方法，具備了TGF-、TNF-的檢測(cè)能力，以及本研究所需的組織病理學(xué)檢查條件。同時(shí)在預(yù)實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得出黃芪能有效抑制體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞TGF-的表達(dá)。因此，本研究具有很強(qiáng)的可行性和較

20、高的成功率。2、項(xiàng)目負(fù)責(zé)人近年來(lái)研究成績(jī)簡(jiǎn)介 近年發(fā)表相關(guān)論文： 近年研究成果：3、研究隊(duì)伍： 4、支撐條件： 五、計(jì)劃進(jìn)度：1、總進(jìn)度和年度進(jìn)度： 2003.012003.03課題準(zhǔn)備，訂購(gòu)動(dòng)物與試劑。 2003.042003.06細(xì)胞培養(yǎng)研究部分。 2003.062003.12動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分。 2003.062004.09臨床部分。 2004.092004.12總結(jié)資料，分析結(jié)果，科研鑒定。2、項(xiàng)目完成形式：（1）項(xiàng)目完成可通過(guò)論文形式考察，預(yù)計(jì)可在核心期刊發(fā)表論文4-6篇。（2）細(xì)胞培養(yǎng)研究部分通過(guò)對(duì)TGF-表達(dá)的檢測(cè)可以了解高糖在腹膜間皮細(xì)胞TGF-表達(dá)中作用，了解黃芪在拮抗TGF-過(guò)度

21、表達(dá)中的作用。（3）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分通過(guò)腹膜組織病理學(xué)檢查了解黃芪對(duì)腹膜間皮細(xì)胞損傷的保護(hù)以及抑制腹膜纖維化方面的作用，可通過(guò)病理切片形式表達(dá)。（4）臨床研究部分可通過(guò)治療前后患者TGF-、TNF-水平以及巨噬細(xì)胞吞噬功能了解腹膜功能的改變，用差異性來(lái)表示。（5）通過(guò)成果考核。（6）成果可達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。六、項(xiàng)目研究預(yù)期成果及效益：預(yù)期達(dá)到的主要技術(shù)指標(biāo)：（1）黃芪有效抑制體外培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞的TGF-的分泌。（2）應(yīng)用黃芪后在腹膜透析動(dòng)物模型腹膜組織病理檢查中發(fā)現(xiàn)黃芪能維護(hù)腹膜間皮細(xì)胞的完整性和抑制腹膜纖維化的發(fā)生。（3）黃芪能改善腹膜透析病人的腹膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的免疫功能。（4）該研究成果預(yù)期達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平，為臨床上阻止/延緩腹膜功能衰竭提供新的治療方法。 經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益：通過(guò)本課題的系列研究，預(yù)期可以明確黃芪有效阻止/延緩長(zhǎng)期腹膜透析病人腹膜功能衰竭的進(jìn)程，從而延長(zhǎng)腹膜透析時(shí)間、提高腹膜透析質(zhì)量。從經(jīng)濟(jì)效益來(lái)講，腹膜透析是一種價(jià)格低廉的腎臟替代療法，長(zhǎng)期的腹膜透析必將大大減輕社會(huì)及其個(gè)人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。從社會(huì)效