黃芪對腹膜透析效能及腹膜間皮細胞與腹腔免疫功能的影響江蘇申報

1、登記序號： 計劃類別： 分類代碼： 項目編號： 科技項目計劃設計任務書 項目名稱：黃芪對腹膜透析效能及腹膜間皮細胞與腹腔免 疫功能的影響 承擔單位： 單位地址： 郵編： 項目負責人： 電話： 職務職稱： 主管部門： 南京市衛(wèi)生局 填報日期： 2002年04月26日 江蘇省科學技術(shù)廳二OO一年制一、立項依據(jù)：1、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢及理論實踐依據(jù)： 隨著腹膜透析（Peritoneal Dialysis，PD）技術(shù)的不斷提高和透析理論的日趨完善，尤其是1976年P(guān)opovich提出的連續(xù)非臥床腹膜透析（Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis，CAPD

2、）治療方法帶來了腹膜透析的空前繁榮。近年來的流行病學資料表明接受腹膜透析治療的終末期腎功能不全（End-Stage Renal Disease，ESRD）患者正以每年7.5%的比例迅速增長，目前全球已有超過120000的患者在接受腹膜透析治療。腹膜透析因其相對于血液透析更高的生活質(zhì)量、顯著的殘余腎功能保護、優(yōu)于或等于血液透析的生存率以及較少的資金花費，故有作者提出，腹膜透析應該是腎臟替代療法的首選1,2。 然而，隨著腹膜透析患者壽命的延長，腹膜透析的遠期并發(fā)癥腹膜功能衰竭已成為ESRD患者透析技術(shù)性失敗的最重要的原因3，并成為制約腹膜透析發(fā)展的“瓶頸”。 資料顯示約1/3的腹膜透析患者6年后因

3、腹膜功能衰竭而退出透析治療。腹膜功能衰竭與長期腹膜透析后腹膜結(jié)構(gòu)和功能破壞進而導致腹膜超濾失敗以及溶質(zhì)轉(zhuǎn)運功能障礙密切相關(guān)4。腹膜透析液的生物不相容性是導致腹膜功能衰竭的首要原因，腹膜間皮細胞作為腹膜組成部分在這一過程中扮演著重要角色。近年來隨著人腹膜間皮細胞標準培養(yǎng)方法和腹膜透析動物模型的確立，腹膜功能衰竭的機理得以初步闡明。腹膜間皮細胞在長期非生理性透析液刺激下，轉(zhuǎn)移生長因子（TGF-）mRNA過度表達，TGF-作為細胞增殖與細胞外基質(zhì)合成的重要調(diào)節(jié)因子，導致細胞外基質(zhì)合成增加和腹膜纖維化5，最終導致腹膜超濾失敗和溶質(zhì)轉(zhuǎn)運功能障礙。同時TGF-也是調(diào)節(jié)細胞凋亡的重要細胞因子，組織病理學證實

4、腹膜功能衰竭的重要特征表現(xiàn)為腹膜間皮細胞的喪失，過多的TGF-表達將增加間皮細胞的凋亡，導致間皮細胞的完整性受到破壞，研究表明完整的間皮細胞層可以顯著延緩腹膜纖維化的進程。其次，腹膜透析的主要并發(fā)癥腹膜感染也是導致腹膜功能衰竭的重要原因,反復的炎癥刺激使腹膜局部高水平TGF-持續(xù)存在致使腹膜發(fā)生纖維化和硬化6。目前公認長期腹膜透析時腹腔細胞免疫功能抑制是導致腹膜反復感染的主要原因,尤其是被認為是腹腔細胞免疫功能最重要組成部分和腹膜抵抗細菌感染第一道屏障的巨噬細胞功能的明顯抑制。研究表明，腹膜在長期非生理性透析液的刺激下，巨噬細胞功能受到抑制，當腹膜發(fā)生感染時透析患者腹腔巨噬細胞功能指標包括吞噬

5、指數(shù)、白細胞介素1（IL-1）和腫瘤壞死因子（TNF-）水平顯著降低，如果改用更符合生理條件的透析液則可以使腹腔巨噬細胞功能得到明顯增強，從而增強腹膜對感染的抵抗能力，減少腹膜炎的發(fā)生7。最近，腹膜血管在腹膜功能衰竭中的作用也得到重視，充足的血流除了能有效增強腹膜的抵抗力減少腹膜炎的發(fā)生外8，也是維持長期腹膜透析患者腹膜轉(zhuǎn)運功能的重要因素。腹膜血管血流量減少時腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運和腹膜超濾率均顯著下降9，研究顯示長期腹膜透析患者腹膜血管內(nèi)皮細胞依賴的血管舒張因子顯著減少，從而影響腹膜透析的效能，而如在腹膜透析液中添加擴血管物質(zhì)硝普納則能有效提高腹膜透析患者的透析效果。 基于上述研究結(jié)果，近年來臨床醫(yī)師

6、一直致力于兩方面的研究。一是研究更符合生理條件以及不影響腹膜免疫功能的全新的腹膜透析液。雖然已有諸如含多聚糖、含氨基酸、含碳酸氫根等多種透析液的體外實驗的報道，但事實上所有這些透析液并不能完全替代葡萄糖作為滲透性物質(zhì)的作用，其臨床應用前景尚不明確。另一方面，腎臟病醫(yī)師通過在現(xiàn)有的透析液中添加一些物質(zhì)來達到保護和改善腹膜功能的目的。有研究表明在透析液中加入雙嘧莫達能顯著降低小鼠腹透液中TGF-的含量，而加入透明質(zhì)酸可以在保護腹膜間皮細胞方面起到一定的效果。中藥黃芪是一種含有多糖、甙、黃酮和微量元素等多種成分的物質(zhì)，其具有多重藥理作用10。黃芪能顯著抑制炎癥因子TGF-的表達，從而延緩肝臟、腎臟等

7、多種臟器疾病時發(fā)生纖維化的進程；能明顯減緩人胚二倍體細胞自然衰老過程延長細胞壽命約1/3左右11；能有效地調(diào)節(jié)細胞免疫功能，通過向小鼠腹腔注射黃芪可以發(fā)現(xiàn)腹腔巨噬細胞吞噬功能得到增強，從而增強腹膜抗菌能力；黃芪還具有擴血管的作用，研究顯示其能顯著抑制血管收縮物質(zhì)內(nèi)皮素的釋放，從而可能起到擴張血管增加血流量的作用12。根據(jù)黃芪的上述作用，可以推測，在腹膜透析液中加入黃芪可以起到延長腹膜間皮細胞的壽命、抑制間皮細胞TGF-的分泌、提高腹腔巨噬細胞功能、改善局部微循環(huán)，從而阻止/延緩腹膜纖維化和防止腹膜感染的發(fā)生，達到阻止/延緩腹膜功能衰竭的目的。然而關(guān)于黃芪在腹膜透析中的應用尚無相關(guān)報道。 主要參

8、考文獻：1. Thodis E, Passadakis P, Vargemezis V, Oreopoulos DG.Peritoneal dialysis: better than, equal to, or worse than hemodialysis? Data worth knowing before choosing a dialysis modality. Perit Dial Int ,2001; 21:25-35.2. Van Biesen W, Vanholder R, Lameire N.The Role of Peritoneal Dialysis as the Fir

9、st-Line Renal Replacement Modality.Perit Dial Int , 2000;20: 375 - 383 3. An S. De Vriese, Siska Mortier, Norbert H,et al.What happens to the peritoneal membrane in long-term peritoneal dialysis? Perit Dial Int, 2001;Vol. 21 ;:S9-284Devuyst O,Topley N,Williams JD.Morphological and functional changes

10、 in the dialysed peritoneal cavity:impact of more biocompatible solutions.Nephrol Dial Transplant,2002;17(3):12-55.Blobe GC,Schiemann WP,Lodish HF.The role of transforeing growth factor beta in human disease.N ENGL J Med ,2000;342:1350-86Lin CY,Chen WP,Yang LY,et al.Persistent transforming growth fa

11、ctor-betal 1 expression may ptedict peritoneal fibrosis in CAPD patients with frequent peritonitis ocurrence.Am J Nephrol,1998;18:513-97.Jones S,Holmes CJ,Mackenzie RK,etal.Continuous dialysis with bicarbonate/lactate-buffered peritoneal dialysis fluids in a long-term improvement in ex vivo peritone

12、al macrophage function.J A Soc Nephrol,2002;13:S97-1038Park MS.Factors increasing severnity of peritonitis in long-term peritoneal dialysis patients.Adv Ren Replace Ther，1998；5：185-939.Ronco C,Brendolan A,Crepaldi C,et al.Ultrafiltration and clearence studies in human isolated pertoneal vascular loo

13、ps.Blood Purif,1994;12:233-4210.耿長山。黃芪的免疫藥理研究進展。中西醫(yī)結(jié)合雜志，1986；6：62-6411孟慶云。中國中醫(yī)藥發(fā)展50年。P28012伍敦裕，林海玲。黃芪注射液治療慢性腎功能不全患者血漿內(nèi)皮素變化及其意義。實用醫(yī)學雜志，1998；14：6112、研究目的與意義： 研究目的： 通過體外人腹膜間皮細胞培養(yǎng)觀察中藥黃芪在抑制由高糖引起的TGF-過度表達中的作用，通過動物實驗從組織病理學角度觀察黃芪對腹膜間皮細胞完整性的維護和腹膜纖維化的抑制以及巨噬細胞功能調(diào)節(jié)等方面的作用，通過臨床觀察了解黃芪對腹膜轉(zhuǎn)運功能和免疫功能的影響，從不同層面了解黃芪在阻止/延

14、緩腹膜功能衰竭中的作用及其機制，為臨床上改善長期腹膜透析患者透析療效提供一種新的治療方法。 研究意義： 隨著臨床腹膜透析的廣泛應用以及腹膜透析患者壽命的延長，臨床上因長期腹膜透析導致腹膜功能衰竭進而透析失敗的患者越來越多。中藥黃芪在我國分布廣泛且有2000多年的應用歷史。目前臨床上已有黃芪注射液制劑，并且由于黃芪可以直接注入腹腔，因此通過從不同層面了解黃芪在阻止/延緩腹膜功能衰竭中的作用及其機制的研究，在臨床上推廣使用黃芪來阻止/延緩腹膜功能衰竭從而延長ESRD患者腹膜透析時間、提高透析質(zhì)量、減少透析失敗率，提高腹膜透析遠期療效具有廣泛的應用前景。3、技術(shù)查新： 參見附頁。二、研究內(nèi)容：研究內(nèi)

15、容： 本課題采用體外細胞培養(yǎng)、動物實驗、組織病理學與臨床相結(jié)合的系統(tǒng)研究方法，從多個方面研究中藥黃芪在防止/延緩腹膜功能衰竭中的作用，并從不同層面和角度解釋其作用機理。通過體外人腹膜間皮細胞培養(yǎng)了解黃芪在抑制間皮細胞TGF-表達方面的作用；通過動物實驗從組織病理學的角度直觀了解黃芪在間皮細胞保護以及在阻止/延緩腹膜纖維化中的作用；通過臨床應用，了解黃芪對腹膜轉(zhuǎn)運功能以及免疫功能方面的影響。關(guān)鍵技術(shù)和技術(shù)難點：（1）體外人腹膜間皮細胞培養(yǎng)及干預方法的建立；（2）動物腹膜透析模型及干預方法的建立； （3）TGF-、TNF-免疫組化檢測；（4）巨噬細胞吞噬功能的誘導及檢測；（5）標準腹膜透析腹膜轉(zhuǎn)運

16、功能改變的研究。課題的特色和創(chuàng)新之處：（1）腹膜功能衰竭是一多因素參與的病理過程，由于西藥作用較為單一，因此在如何有效阻止/延緩腹膜功能衰竭的研究中顯得較為局限，而中藥黃芪具有多重藥理作用，在阻止/延緩腹膜功能衰竭的研究中具有較大的優(yōu)勢。（2）由于部分藥物無法進行腹腔內(nèi)應用，因此以往的研究大多停留在體外試驗的水平，而黃芪可以安全地應用于腹腔內(nèi)注射，本課題的研究成果能夠直接應用于臨床。（3）通過從體外細胞培養(yǎng)、動物實驗、組織病理學以及臨床全面地對黃芪在阻止/延緩腹膜功能衰竭中的作用及機制進行研究，至今尚未見類似的研究報道。主要技術(shù)指標：（1）黃芪抑制間皮細胞TGF-分泌的指標；（2）反映巨噬細胞

17、免疫功能的TNF-分泌水平以及吞噬功能的指標；（3）黃芪對腹膜間皮細胞的維護和抑制纖維化的指標；（3）黃芪對腹膜轉(zhuǎn)運功能的影響。三、研究方法及技術(shù)路線：研究工作總體思路： 本研究首先通過人腹膜間皮細胞體外培養(yǎng)的方法在培養(yǎng)基中添加黃芪觀察其抑制由高糖引起的間皮細胞TGF-過度表達中的作用，了解黃芪與腹膜間皮細胞TGF-表達之間的關(guān)系。然后通過腹膜透析動物模型從組織病理學角度直觀了解黃芪對腹膜間皮細胞損傷的保護以及抑制腹膜纖維化方面的作用。最后通過在臨床上的應用了解黃芪對腹膜轉(zhuǎn)運功能以及腹膜免疫功能的影響，并探討其作用機制。從而為臨床上阻止/延緩長期腹膜透析患者因腹膜纖維化、腹膜反復感染導致的腹膜

18、功能衰竭提供新的治療方法。技術(shù)路線：（1）體外細胞培養(yǎng)部分： 從擇期手術(shù)小網(wǎng)膜切除的標本獲得人網(wǎng)膜組織，按照文獻方法培養(yǎng)間皮細胞，通過調(diào)整原代（1-9代）人腹膜間皮細胞培養(yǎng)液中葡萄糖濃度，在1.5%、4.5%葡萄糖條件下觀察添加與不添加黃芪對腹膜間皮細胞TGF-表達的影響，TGF-用免疫組化方法檢測。（2）動物模型部分： 按照標準腹膜透析小鼠動物模型建立方法建立小鼠腹膜透析模型，分別采用添加和不添加黃芪的葡萄糖濃度為1.5%、4.5%的透析液進行腹膜透析，8周后取小鼠腹膜組織，10%甲醛溶液固定、脫水、 石蠟包埋后HE、PAS、PASM染色，在光學顯微鏡下進行病理組織學檢查。（3）臨床部分：

19、在臨床上選擇長期腹膜透析患者，采用自身對照的方法觀察添加黃芪前后患者腹膜轉(zhuǎn)運功能和患者透析液中TNF-濃度以及巨噬細胞吞噬功能的變化。（4）總結(jié)資料，分析結(jié)果。研究方法：（1）組織細胞培養(yǎng)方法。（2）動物實驗學研究方法。（3）組織病理學方法。（4）生化分析方法。四、現(xiàn)有研究條件和工作基礎(chǔ)：1、現(xiàn)有工作基礎(chǔ)： -臨床上有大量的長期腹膜透析的隨訪病人。研究者已成功掌握了人腹膜間皮細胞培養(yǎng)方法和腹膜透析小鼠動物模型建立方法，具備了TGF-、TNF-的檢測能力，以及本研究所需的組織病理學檢查條件。同時在預實驗中已經(jīng)得出黃芪能有效抑制體外培養(yǎng)人腹膜間皮細胞TGF-的表達。因此，本研究具有很強的可行性和較

20、高的成功率。2、項目負責人近年來研究成績簡介 近年發(fā)表相關(guān)論文： 近年研究成果：3、研究隊伍： 4、支撐條件： 五、計劃進度：1、總進度和年度進度： 2003.012003.03課題準備，訂購動物與試劑。 2003.042003.06細胞培養(yǎng)研究部分。 2003.062003.12動物實驗部分。 2003.062004.09臨床部分。 2004.092004.12總結(jié)資料，分析結(jié)果，科研鑒定。2、項目完成形式：（1）項目完成可通過論文形式考察，預計可在核心期刊發(fā)表論文4-6篇。（2）細胞培養(yǎng)研究部分通過對TGF-表達的檢測可以了解高糖在腹膜間皮細胞TGF-表達中作用，了解黃芪在拮抗TGF-過度

21、表達中的作用。（3）動物實驗部分通過腹膜組織病理學檢查了解黃芪對腹膜間皮細胞損傷的保護以及抑制腹膜纖維化方面的作用，可通過病理切片形式表達。（4）臨床研究部分可通過治療前后患者TGF-、TNF-水平以及巨噬細胞吞噬功能了解腹膜功能的改變，用差異性來表示。（5）通過成果考核。（6）成果可達到國際先進水平。六、項目研究預期成果及效益：預期達到的主要技術(shù)指標：（1）黃芪有效抑制體外培養(yǎng)人腹膜間皮細胞的TGF-的分泌。（2）應用黃芪后在腹膜透析動物模型腹膜組織病理檢查中發(fā)現(xiàn)黃芪能維護腹膜間皮細胞的完整性和抑制腹膜纖維化的發(fā)生。（3）黃芪能改善腹膜透析病人的腹膜轉(zhuǎn)運功能和增強巨噬細胞的免疫功能。（4）該研究成果預期達到國際領(lǐng)先水平，為臨床上阻止/延緩腹膜功能衰竭提供新的治療方法。 經(jīng)濟效益和社會效益：通過本課題的系列研究，預期可以明確黃芪有效阻止/延緩長期腹膜透析病人腹膜功能衰竭的進程，從而延長腹膜透析時間、提高腹膜透析質(zhì)量。從經(jīng)濟效益來講，腹膜透析是一種價格低廉的腎臟替代療法，長期的腹膜透析必將大大減輕社會及其個人的經(jīng)濟負擔。從社會效