W4304酸性氧化鋁固相萃取柱和陽離子交換柱在獸藥檢測中的

1、農(nóng)產(chǎn)品/食品質(zhì)量安全檢測技術(shù)課程-微教材微課編號(hào)W4304微課名稱酸性氧化鋁固相萃取柱和陽離子交換柱在獸藥檢測中的應(yīng)用所屬模塊農(nóng)產(chǎn)品/食品中農(nóng)藥殘留檢測子模塊M4-3水產(chǎn)品中違禁抗菌藥物的檢測海蝦中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定關(guān)鍵詞凈化；固相萃取柱；陽離子交換柱是否通用通用 農(nóng)產(chǎn)品 食品是否重點(diǎn)建設(shè)是 否微課類型實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)型微課形式混合拍攝式微課類型實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)型教學(xué)目標(biāo)掌握固相萃取柱和離子交換柱的原理及使用方法。教學(xué)內(nèi)容知識(shí)點(diǎn)技能點(diǎn)1、固相萃取方法的建立與優(yōu)化2、酸性氧化鋁固相萃取柱特點(diǎn)3、陽離子交換柱特點(diǎn)1、孔雀石綠和結(jié)晶紫獸殘凈化的規(guī)范操作2、固相萃取儀的使用知識(shí)講解一固相萃取方法的建立與優(yōu)化

2、固相萃取，即Solid Phase Extraction，簡稱 SPE，是從八十年代中期開始發(fā)展起來的一項(xiàng)樣品前處理技術(shù)。主要用于樣品的分離，凈化，和富集。主要目的在于降低樣品基質(zhì)干擾，提高檢測靈敏度。SPE是利用選擇性吸附于選擇性洗脫的液相色譜分離法原理。較常用的方法是使液體樣品溶液通過吸附劑，保留其中被測物質(zhì)，在選擇適當(dāng)強(qiáng)度溶劑沖去雜志，然后用少量溶劑迅速洗脫被測物質(zhì)，從而達(dá)到快速分離凈化與濃縮的目的。也可選擇性吸附干擾雜質(zhì)，而讓被測物質(zhì)流出；或同時(shí)吸附雜質(zhì)和被測物質(zhì)，再使用合適的溶劑選擇性洗脫被測物質(zhì)。在樣品分離過程中如何選擇固相萃取柱及如何分離是被檢測物質(zhì)是一個(gè)相對比較困難的問題，下面

3、主要介紹一下固相萃取方法的建立和優(yōu)化：固相萃取技術(shù)使用起來雖然比液液萃取簡單，但建立一個(gè)固相萃取的方法并無快捷方式可走。建立固相萃取方法必須考慮與萃取過程相關(guān)的多種因素，歸納起來可從三個(gè)方面考慮：即確定萃取的目的及要求、建立初步的固相萃取方法、方法的優(yōu)化。1確定萃取的目的及要求建立初步的萃取方法要考慮：選擇合適的SPE柱；選擇合適的固相萃取方法；方法的優(yōu)化a) 柱填料的選擇首選根據(jù)目標(biāo)化合物與干擾物的差異，如極性，分子量，pka值等，選擇合適的填料。2.2 固相萃取柱規(guī)格的選擇對于反相、正相和吸附型固相萃取柱來說，被萃取樣品的質(zhì)量不超SPE柱填料的5%；離子交換型的固相萃取柱，必須考慮離子交換

4、的容量。SAX和SCX其吸附容量為0.2mg/g，下表附SPE小柱的容量和洗脫參數(shù)SPE柱上樣容量和洗脫體積的選擇選擇合適的固相萃取方法固相萃取的保留機(jī)制可分為兩種：2.3.1 吸附劑（填料）保留目標(biāo)化合物：絕大多數(shù)化合物應(yīng)用此機(jī)制，填料保留其目標(biāo)組分及少量雜質(zhì)，通過淋洗步驟去除吸附在柱上的少量雜質(zhì)，最后選擇合適的（洗脫）溶劑把目標(biāo)組分洗脫下來。根據(jù)吸附劑的保留機(jī)理可進(jìn)一步分為：（1）反相（C18,C8,CN,Phenyl,C4,C1） 分析物：非極性至中等極性 基質(zhì)：水溶性 方法： 1.活化：通常用水溶性有機(jī)溶劑如甲醇活化，然后用水平衡 2.淋洗：含0-50%極性溶劑的緩沖溶液淋洗雜質(zhì) 3.

5、洗脫：極性或非極性溶劑洗脫目標(biāo)物（2）正相（Silica, Florisil,Diol,NH2） 分析物：中等極性到強(qiáng)極性 基質(zhì)：非極性至中等極性 方法： 1.活化：非極性有機(jī)溶劑 2.洗脫：非極性有機(jī)溶劑（3）陽離子交換（SCX,PRS,COOH） 分析物：陽離子（堿性）化合物 方法： 1.活化：用于非極性有機(jī)溶劑中的樣品時(shí)，可用樣品溶劑來活化；在用于極性溶劑中的樣品時(shí)，可用水溶性有機(jī)溶劑過柱后，然后用水平衡，最后再用適當(dāng)pH值的緩沖溶液進(jìn)行平衡。 2.上樣：樣品溶液pH值要小于其pKa兩個(gè)單位（以保證其帶電荷 ） 3.洗脫：洗脫溶液pH值要大于其pKa兩個(gè)單位（中和分析物的電荷）（4）陰離

6、子交換（SAX,PSA,NH2，PAX/MAX ） 分析物：陰離子（酸性）化合物 方法： 1.活化：用于非極性有機(jī)溶劑中的樣品時(shí)，可用樣品溶劑來活化；在用于極性溶劑中的樣品時(shí)，可用水溶性有機(jī)溶劑活化后，然后用水平衡，最后再用適當(dāng)pH值的緩沖溶液進(jìn)行平衡。 2.上樣：樣品溶液pH值要大于其pKa兩個(gè)單位（以保證其帶電荷 ）。 3.洗脫：洗脫溶液pH值要小于其pKa兩個(gè)單位（中和分析物的電荷）。2.3.2 吸附劑（填料）保留雜質(zhì)：食品中色素等雜質(zhì)的去除多用此機(jī)制。填料保留雜質(zhì)而不保留或只保留極少量的目標(biāo)組分，所以上樣后即開始收集目標(biāo)組分，最后用目標(biāo)物所在的溶劑進(jìn)一步洗脫。合并兩部分收集液。 1.活

7、化：以樣品所在的有機(jī)溶劑進(jìn)化活化，1-2柱管體積 2.上樣：提取液轉(zhuǎn)移至柱內(nèi)，并收集流出液 3.洗脫：用樣品所在的有機(jī)溶劑進(jìn)一步洗脫，收集流出液。合并上樣和洗脫流出液。3固相萃取方法的優(yōu)化影響萃取效率的因素1）填料（固定相）- 核心選擇合適的SPE柱是保證理想結(jié)果的前提2）洗脫溶劑的強(qiáng)度：Ø 采用正相固定相時(shí)，溶劑強(qiáng)度隨其極性增強(qiáng)而增加；Ø 采用反相固定相時(shí)，溶劑強(qiáng)度隨極性減弱而增強(qiáng)。3）pH值： 離子交換固定相、被分析物和干擾物質(zhì)的pKa各不相同。通過調(diào)節(jié)pH大小，可以使固定相帶電荷，被分析物帶相反電荷，而使干擾物質(zhì)不帶電荷；或者反過來，使固定相帶電荷，干擾物質(zhì)帶相反電荷

8、，而使被分析物不帶電荷。4）其他.常見問題及解決方法1）分析物回收率低2）萃取重現(xiàn)性差3）洗脫餾分中含有干擾物4）SPE柱流速降低或阻塞具體解決方案如下：1）分析物回收率低 未保留？ 被淋洗？ 未被洗脫或部分洗脫？首先要把上樣液、淋洗液、洗脫液均收集，進(jìn)樣分析，確定問題來源2）重現(xiàn)性差3）洗脫餾分中含有干擾物4）SPE柱流速降低或阻塞二、酸性氧化鋁固相萃取柱特點(diǎn)酸性氧化鋁的pH約為5，具有很高的活性，用酸洗氧化鋁可以使其吸附堿性化合物的能力下降，酸性氧化鋁主要用于吸附極性化合物或具有陰離子官能團(tuán)的化合物。三、陽離子交換柱特點(diǎn)陽離子交換柱，是在高純度的惰性硅膠表面鍵合一種新型的聚合磺酸基陽離子交

9、換配位體。這種獨(dú)特的鍵合結(jié)構(gòu)是一種穩(wěn)定的聚合包膜結(jié)構(gòu)，比普通的聚合物離子交換柱柱效更高，且具有更好的機(jī)械強(qiáng)度和重現(xiàn)性。其特點(diǎn)如下：4.在適用的pH范圍內(nèi)，具有極好的穩(wěn)定性邊學(xué)邊練一、任務(wù)：酸性氧化鋁固相萃取柱和陽離子交換柱在獸藥檢測中的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)樣品：海蝦參考標(biāo)準(zhǔn)：國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20361-2006 水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定 高效液相色譜熒光檢測法二、操作技術(shù)要點(diǎn)：1、凈化1）活化。將PRS柱安裝在固相萃取裝置上，并分別編號(hào)，上端連接酸性氧化鋁固相萃取柱，用大約兩管共5mL乙腈對柱子進(jìn)行活化，一管即為液面剛好達(dá)到萃取柱的柱口。為加快活化速度，應(yīng)打開真空泵，注意調(diào)節(jié)固相萃取儀上的流

10、速旋鈕，使兩個(gè)柱子中的溶液保持成滴流下，不能出現(xiàn)成線流下的情況，以免影響柱效。2）過柱。用巴氏管轉(zhuǎn)移所有的孔雀石綠、結(jié)晶紫提取液到柱上，控制流速使其成滴流下。再用乙腈洗濃縮瓶兩次，每次大約，采用漩渦振蕩使內(nèi)容物完全溶解，依次過柱，注意控制柱子中樣液的流速為成滴流下，以使樣液有足夠的時(shí)間和萃取劑發(fā)生作用。待樣液全部滴完，先關(guān)閉流量控制旋鈕，再關(guān)閉真空泵。棄去酸性氧化鋁柱。注意，不論下方的PRS柱是否流干，只要上方的酸性氧化鋁柱流干以后，就可以將其拿掉。 將下方的PRS柱取下放到氮吹儀上，調(diào)整氮吹針距柱的填料表面1cm左右，調(diào)整合適的氮?dú)饬髁?，吹至近干。接著?0 mL乙腈與乙酸銨溶液混合，準(zhǔn)備進(jìn)

11、行洗脫。然后將吹干的固相萃取柱再裝到固相萃取儀上，在三根柱子下方放入三根10 mL具塞試管。然后分別在三根柱子中加入2.5 mL上述等體積混合的乙腈和0.1 mol/L乙酸銨溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。剛開始洗脫時(shí)不開真空泵，目的是防止洗脫液流速過快，與PRS柱上吸附的樣品交換不夠徹底。當(dāng)流速開始變慢時(shí)，可以將真空泵打開。洗脫完成后，在具塞試管中，用乙腈將樣液定容至2.5 mL。最后，將標(biāo)樣轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，待測。加樣用的巴氏管要先潤洗。再用注射器將樣液從具塞離心管中吸出，取掉針頭，接上m濾膜，將樣液勻速過濾入1.5 mL自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中，待測。注意注射器在丟棄的時(shí)候，必須蓋上針蓋，避免引起危險(xiǎn)

12、。過濾的時(shí)候，速度要均勻，不能太快，以免膜破裂。拓展閱讀應(yīng)用智能專家系統(tǒng)軟件建立并優(yōu)化固相萃取方法：建立并優(yōu)化一個(gè)固相萃取方法需要考慮許多因素。這對于一般的分析工作者而言，在開始階段是有一定難度的。目前，市場上已經(jīng)有一些商品化的智能專家系統(tǒng)軟件能夠幫助我們在較短的時(shí)間里初步建立一個(gè)固相萃取方法，并可以根據(jù)該方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果給出對方法優(yōu)化的建議。例如美國Phenomenex公司的Sanlple Preparation Method Development Software(建立樣品制備方法軟件)。 該軟件的操作十分簡單，使用者只需將樣品的信息輸入軟件，就可以得到相應(yīng)的固相萃取方法。下面我們以尼古丁

13、的固相萃取為例，對該智能專家系統(tǒng)軟件的操作進(jìn)行介紹。 啟動(dòng)該軟件后，首先進(jìn)入樣品信息窗口。在樣品基質(zhì)(sample matrix)欄中，根據(jù)樣品基質(zhì)選擇相應(yīng)的表述，例如：血漿(plasma)、全血(whole blood)、尿液(urine)、組織萃取物(水溶液，tisstle extract aqueous)、組織萃取物(水溶性溶劑，tisstle extract water so1uble solvent)、生物組織萃取物(其他溶劑，other solvent)、水(water，<10 mgL)、水(water，1050mgL)、水(water，50200 mgL)、水(water，

14、>200 mgL)等。然后，選定過柱樣品體積。根據(jù)最后的檢測手段，選擇洗脫溶劑的類型：100有機(jī)溶劑、可以有水或符合GC要求。另外，根據(jù)分析的要求，確定萃取方法是針對指定化合物(compotmd specific method)還是用于快速篩選分析(high throughputscreer、)。在輸入完樣品基質(zhì)信息后，接著就是要輸入目標(biāo)化合物的信息。這些信息包括：目標(biāo)化合物的芳香性、pH穩(wěn)定性、分子式以及相關(guān)官能團(tuán)的信息。在相關(guān)官能團(tuán)詳細(xì)信息中，可以選擇分子結(jié)構(gòu)圖(Use Molfile)、結(jié)構(gòu)(Enter struct ures)或pKa lg P(即lg Kow)(Enter 1g

15、 PpKa)。之后，點(diǎn)擊右下角的Create SPE Metlod紅色鍵，軟件就給出了初步的SPE方法。 使用的固相萃取方法，包括SPE柱種類以及柱預(yù)處理、柱平衡、樣品過柱、柱洗滌以及最后的洗脫步驟所使用的溶液以及體積。用鼠標(biāo)點(diǎn)擊每一步驟，可以顯示更進(jìn)一步的信息。例如：萃取柱的類型、液體過柱的流速等。點(diǎn)擊軟件對話框右下角的藍(lán)色Publish按鈕，可以將所輸人的相關(guān)信息及固相萃取方法以Word文檔方式存檔及打印。 如果根據(jù)所建立的初步方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果沒有達(dá)到預(yù)期的目標(biāo)，可以點(diǎn)擊Troubleshoot按鈕，該軟件可以給出相應(yīng)的參考解決方案。例如，回收率偏低，軟件要求實(shí)驗(yàn)人員判斷是顯示的哪個(gè)因素導(dǎo)致回收率偏低，軟件就會(huì)給出相應(yīng)的建議。這個(gè)過程相當(dāng)于我們