人參皂苷Rg1對AD模型大鼠腦片PTau、PKA影響的實驗研究(一)

1、人參皂苷Rg1對AD模型大鼠腦片PTau、PKA影響的實驗研究(一)    作者：李璽 張欣 張智燕 袁海峰 權乾坤【摘要】 目的 研究人參皂苷Rg1對AD模型大鼠腦片磷酸化微管相關蛋白(PTau)、蛋白激酶A(PKA)表達的調(diào)控作用。方法 采用岡田酸誘導大鼠培養(yǎng)腦片Tau 蛋白過度磷酸化，制備成AD模型，運用免疫組織化學、圖像分析技術等方法，觀察人參皂苷Rg1對各組大鼠腦片PTau、PKA表達的影響。結果 模型組PTau、PKA表達水平明顯高于空白對照組(P0.01);人參皂苷Rg1各劑量組PTau、PKA表達水平雖高于空白對照組，但低于模型組(P0.

2、01或P0.05)，且大、中劑量組優(yōu)于小劑量組;人參皂苷Rg1呈一定的劑量依賴性下調(diào)PTau、PKA的表達。結論 人參皂苷Rg1能通過降低PTau水平、下調(diào)PKA的表達從而減緩神經(jīng)纖維纏結、老年斑的形成，以發(fā)揮抗癡呆的作用。 【關鍵詞】 人參皂苷Rg1 ;阿爾茨海默病;Tau蛋白;蛋白激酶A【Abstract】 Objective To observe the effects of ginsenoside Rg1 on the expressions of PTau and PKA on the brain slices of AD model rats. Methods AD models

3、were prepared by culturing rat brain slices with okadaic acid to induce Tau protein hyperphosphorylation. The effects of ginsenoside Rg1 on the expressions of PTau and PKA in AD model rat brain slices in each group were observed by immunohistochemistry and image analysis technology. Results The expr

4、essions of PTau and PKA in model group were significantly higher than those in normal control group(P0.01). The expressions of PTau and PKA in Ginsenoside Rg1 groups were significantly lower than those in normal control group, but were higher than those in model group(P0.01 or P0.05), and Ginsenosid

5、e Rg1 showed a dosedependent reduction PTau, PKA expression. Conclusions Ginsenoside Rg1 plays the role of antidementia through inhibiting the expressions of PTau and PKA and slowing the formation of neurofibrillary tangles.【Key words】 Gensenoside Rg1;Alzheimers disease;Protein Tau;cAMPdependent kin

6、ase A 人參皂苷Rg1是從人參中提取的一類生物活性成分1，有增強記憶和認知功能的作用，已成為研究中藥抗癡呆的熱點之一。磷酸化微管相關蛋白(Protein Tau，PTau)存在于正常人的大腦中，但是Tau 蛋白過度磷酸化參與了神經(jīng)原纖維纏結(neuro fibrillary tangle，NFT)的形成，成為老年性癡呆(Alzheimer disease，AD)的核心病理變化，并且NFT的數(shù)目與AD病人的癡呆程度密切相關。研究表明cAMP依賴的蛋白激酶A(cAMPdependent kinase，PKA)是導致Tau蛋白發(fā)生磷酸化的關鍵激酶2，本實驗參照國內(nèi)外有關文獻35，采用岡田酸(ok

7、adaic acid，OA)誘導的大鼠培養(yǎng)腦片方法，建立Tau 蛋白過度磷酸化的AD模型，觀察人參皂苷Rg1對PTau、PKA的調(diào)控作用，旨在闡明人參皂苷Rg1抗癡呆作用機制。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠10只，均清潔級(西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供)。鼠齡：45 w。體重：110130 g。每只鼠取400 m厚海馬及皮層腦片5張，隨機分為5組：空白對照組，模型組，人參皂苷Rg1大、中、小劑量組(每組10張腦片)。1.1.2 藥物與試劑 人參皂苷Rg1購自吉林宏久生物科技股份有限公司，純度98.99%，使用前溶于生理鹽水配成濃度分別為60 mg/m

8、l、120 mg/ml和240 mg/ml的三種溶液。OA購自美國ALEXIS生物制劑公司，純度98% ，使用前溶于10%二甲基亞砜(dimethy sulphoxide，DMSO)，配制成1 mg/ml DMSO溶液待用。PTau和PKA多克隆抗體及免疫組織化學試劑盒(SABC)購自武漢博士德生物工程有限公司。1.2 方法1.2.1 動物模型的建立1.2.1.1 離體海馬腦片的制備 大鼠在6%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉下切開頭皮,暴露顱骨,迅速斷頭，取腦，置于04經(jīng)95% O2和5% CO2混合氣體飽和的人工腦脊液冰水混合物中,洗凈血液并降溫后，用振動切片機以振幅8檔，速度3檔行冠狀

9、切片切34片海馬腦片，厚度400 m 。然后取海馬及皮層腦片，挑選形態(tài)較好的腦片置入盛有人工腦脊液的6孔板中培養(yǎng)，溫度(32.0±0.5)中孵育12 h，整個過程持續(xù)通入混合氧氣(95%O2+5% CO2)。人工腦脊液成分：(mmol/L)(150 NaCl，2 CaCl2，1.2 MgSO4，0.5 KH2PO4，1.5 K2HPO4，10 glucose，pH7.4) 。1.2.1.2 離體海馬腦片的分組 空白對照組、模型組、 人參皂苷Rg1大、中、小劑量組腦片開始均培養(yǎng)于人工腦脊液中不做任何處理，1 h后人參皂苷大、中、小劑量組分別加入濃度為60、120、240 mol/L的人

10、參皂苷Rg1。培養(yǎng)至3 h時，模型組和各藥物干預組分別加入OA至其濃度達到1 mol/L。至6 h時，取出腦片。1.2.2 標本制備及檢測指標1.2.2.1 標本制備 取出的腦片迅速經(jīng)人工腦脊液清洗后，用4%多聚甲醛固定4 h，取出，轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液浸泡至沉底，做冰凍切片，切片10 m厚，每張切片含皮層、海馬、齒狀回，然后進行免疫組化染色。1.2.2.2 指標檢測 組織切片經(jīng)抗原修復，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min ，一抗PTau(ser202)1100，一抗PKA 1100，4過夜，生物素標記的二抗和SABC 試劑各在室溫下作用30 min ，最后DAB 顯色，蘇木素輕度復

11、染，PBS 代替一抗作陰性對照。分別檢測各組腦片皮層、海馬、齒狀回的PTau、PKA陽性表達情況，采用Qwin550CW圖像信號采集與分析系統(tǒng)進行灰度分析， 每張切片同一區(qū)域中，隨機選取6個視野，檢測面積相同，取其平均值作為該切片目標區(qū)域的平均灰度值。1.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析法和LSDt檢驗。2 結 果2.1 OA對大鼠培養(yǎng)腦片PTau、PKA表達的影響 與空白組比較，模型組PTau陽性反應物質(zhì)表達增加(P0.01)，模型組PKA陽性反應物質(zhì)除齒狀回外其他部位表達明顯增加(P0.01)。見表1、表2。2.2 人參皂苷Rg1對AD模型大鼠腦片PTau表

12、達的影響 與模型組比較，人參皂苷Rg1各劑量組PTau陽性反應物質(zhì)均有不同程度減少(P0.05或P0.01);人參皂苷Rg1各劑量組之間比較，在除CA3和齒狀回外的其他腦區(qū)大劑量組較中、小劑量組更有效降低各區(qū)PTau的表達(P0.05或P0.01)。見表1，圖1。2.3 人參皂苷Rg1對AD模型大鼠腦片PKA表達的影響 人參皂苷Rg1各劑量組與模型組比較，PKA表達均有不同程度減少(P0.05或P0.01);人參皂苷Rg1各劑量組之間比較，CA1區(qū)大劑量組和小劑量組間有差異性(P0.05)，其余各區(qū)兩劑量組無明顯差異(P>0.05)，在各腦區(qū)中、小劑量組之間無明顯差異性(P>0.0

13、5)。見表2，圖2。表1 人參皂苷Rg1對AD模型大鼠腦片PTau表達的影響表2 人參皂苷Rg1對AD模型大鼠腦片PKA的影響(x±s，灰度值)3 討 論NFT是AD患者腦內(nèi)主要病理改變之一，其產(chǎn)生的原因是Tau蛋白的過度磷酸化。正常情況下Tau蛋白磷酸化和去磷酸化處于平衡狀態(tài)，Tau蛋白過度磷酸化后，其促進微管組裝的生物活性就會喪失，導致細胞骨架的結構異常而形成NFT。PKA可直接參與tua蛋白過度磷酸化。PKA在體外可使重組Tua蛋白多個位點(Ser214、Ser409 、Ser262)磷酸化，改變其空間結構，釋放或隱蔽其他可被磷酸化的位點，從而增強或抑制其他激酶對Tua蛋白的后

14、續(xù)磷酸化作用2。本實驗以OA誘導大鼠培養(yǎng)腦片Tau蛋白過度磷酸化，模型組大鼠腦片的HE染色可見少量細胞結構的破壞，及少量膠質(zhì)細胞增生，未見細胞層厚度的變化，與文獻報道一致6;模型組大鼠腦片的免疫組化染色可見PTau陽性反應物質(zhì)表達比空白對照組明顯增加，表明成功建立AD模型。本實驗發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1各劑量組PTau、PKA的表達比模型組明顯降低，表明人參皂苷Rg1能有效減輕OA引起的Tau蛋白過度磷酸化，從而減輕NFT的形成。人參皂苷Rg1各劑量組之間比較，PTau、PKA的表達隨人參皂苷Rg1劑量的增加而減少，表明人參皂苷Rg1干預呈現(xiàn)量效關系下調(diào)PTau、PKA的表達。本實驗從代表AD本質(zhì)病

15、理變化的NFT形成方面，揭示了人參皂苷Rg1抗癡呆作用機制，為人參皂苷Rg1治療AD的研究提供了新靶點、新思路。【參考文獻】1 Byun BH，Shin I，Yoon YS,et al.Modulation of protein kinase C activity in NIH 3T3 cells by plant glycosides from Panax ginsengJ.Planta Med，1997;63(5)：38992.2 施建華,錢 慰,丁紹紅，等.蛋白激酶A催化微管相關蛋白tau磷酸化的研究J.江蘇大學學報(醫(yī)學版)2006;16(6):4858.3 常 艷,薛毅瓏.阿爾茨海默病的發(fā)病機制及研究進展J.中國臨床康復，2004;8(4):6935.4 王德生，張守信.老年性癡呆M.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：157.5