高效液相色譜法

1、實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案高效液相色譜法1 簡(jiǎn)述高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵人裝有填充劑的色譜柱，對(duì)供試品進(jìn)行分離側(cè)定的色譜方法。注人的供試品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離， 并依次進(jìn)人檢測(cè)器， 由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號(hào)。1.1對(duì)儀器的一般要求所用的儀器為高效液相色譜儀，由高壓輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成，儀器應(yīng)按現(xiàn)行國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局“液相色譜儀檢定規(guī)程”定期檢定并符合有關(guān)規(guī)定。色譜柱內(nèi)徑一般為 3.9 4.6 m，填充劑粒徑為 310m。超高效液相色譜儀是適應(yīng)小粒徑（約 2m）填充劑的耐超高壓、小進(jìn)樣量、低死體積、高靈敏度的高效液相色譜儀。1

2、.1.1色譜柱反相色譜柱：以鍵合非極性基團(tuán)的載體為填充劑填充而成的色譜柱。 常見的載體有硅膠、聚合物符合硅膠和聚合物等； 常見的填充劑有十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基鍵合硅膠等。正相色譜柱： 用硅膠填充劑， 或鍵合極性基團(tuán)的硅膠填充而成的色譜柱。 常見的填充劑有硅膠、 氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠等。 氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠也可用作反相色譜。離子交換色譜柱： 用離子交換填充劑填充而成的色譜柱。 有陽離子交換色譜柱和陰離子交換色譜柱。手性分離色譜柱：用手性填充劑填充而成的色譜柱。色譜柱的內(nèi)徑與長(zhǎng)度，填充劑的形狀、粒徑與粒徑分布、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、 載體表面基團(tuán)殘

3、留量， 填充的致密與均勻程度等均影響色譜柱的性能，應(yīng)根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)來選擇合適的色譜柱。溫度會(huì)影響分離效果， 品種正文中未指明色譜柱溫度時(shí)系指室溫，應(yīng)注意室溫變化的影響。為改善分離效果可適當(dāng)提高色譜柱的溫度，但一般不宜超過60。精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案最常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠。反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用， 辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠 ( 如氛基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷等 ) 也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統(tǒng)使用離子交換填充劑 ; 分子排阻色譜系統(tǒng)使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑 ; 對(duì)映異構(gòu)體的

4、分離通常使用手性填充劑。填充劑的性能 ( 如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等 ) 以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果?？讖皆?15nm(lnm=10? ) 以下的填料適于分析分子量小于 2000。的化合物，分子量大于 2000 的化合物則應(yīng)選擇孔徑在 30nm以上的填料。除另有規(guī)定外， 分析柱的填充劑粒徑一般在 3 10m之間。粒徑更?。s2m）的填充劑常用于填裝微徑柱（內(nèi)徑約 2mm)）。使用微徑柱時(shí)， 輸液泵的性能、 進(jìn)樣體積、檢測(cè)池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配 ; 如有必要，色譜條件也需作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。當(dāng)對(duì)其測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生爭(zhēng)議時(shí)，

5、應(yīng)以品種正文規(guī)定的色譜條件的測(cè)定結(jié)果為準(zhǔn)。以硅膠為載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過 40，為改善分離效果可適當(dāng)提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過 60。流動(dòng)相的 pH 值應(yīng)控制在 2-8 之間 . 當(dāng) pH 值大于 8 時(shí)，可使載體硅膠溶解 ; 當(dāng) pH 值小于 2 時(shí)，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。當(dāng)色譜系統(tǒng)中需使用pH 值大于 8 的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、 有機(jī)一無機(jī)雜化填充劑或非硅膠填充劑等 ; 當(dāng)需使用 pH值小于 2 的流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)選用耐酸的填充劑， 如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護(hù)作用的二異丙

6、基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑，或有機(jī)一無機(jī)雜化填充劑等。1.1.2檢測(cè)器最常用的檢測(cè)器為紫外 - 可見分光檢測(cè)器，包括二極管陣列檢測(cè)器，其他常見的檢測(cè)器有熒光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器等。紫外 - 可見分光檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器為選擇性檢測(cè)器，其響應(yīng)值不僅與待測(cè)溶液的量有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)； 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和示精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案差折光檢測(cè)器為通用型檢測(cè)器， 對(duì)所有的化合物均有響應(yīng)， 結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)在蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的響應(yīng)值幾乎僅與被測(cè)物質(zhì)的量有關(guān)。紫外 - 可見分光檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)和示差折光檢測(cè)器的響應(yīng)值與待測(cè)

7、溶液的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系， 但蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的響應(yīng)值與待測(cè)溶液的濃度通常呈指數(shù)關(guān)系，故進(jìn)行計(jì)算時(shí)，一般需經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。不同的檢測(cè)器，對(duì)流動(dòng)相的要求不同。如采用紫外 - 可見分光檢測(cè)器，所用流動(dòng)相應(yīng)符合紫外一可見分光光度法 ( 中國(guó)藥典 2015 年版四部通則 0401) 項(xiàng)下對(duì)溶劑的要求； 采用低波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)， 還應(yīng)考慮有機(jī)相中有機(jī)溶劑的截止使用波長(zhǎng)，并選用色譜級(jí)有機(jī)溶劑。 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器通常不允許使用含不揮發(fā)性鹽組分的流動(dòng)相。1.1.3 流動(dòng)相 反相色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相常用甲醇一水系統(tǒng)和乙腈 - 水系統(tǒng)，用紫外末端波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，宜選用乙腈 - 水系統(tǒng)。流動(dòng)相中應(yīng)盡可能不用緩沖鹽

8、，如需用時(shí)應(yīng)盡可能使用低濃度緩沖鹽。 用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱時(shí)， 流動(dòng)相中有機(jī)溶劑一般不低于 5%，否則易導(dǎo)致柱效下降、色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。正相色譜系統(tǒng)的流動(dòng)相常用兩種或兩種以上的有機(jī)溶劑， 如二氯甲烷和正己烷等。各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除填充劑種類、 流動(dòng)相組分、檢測(cè)器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、 長(zhǎng)度、填充劑粒徑、流動(dòng)相流速、混合流動(dòng)相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測(cè)器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)供試品并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。其中，調(diào)整流動(dòng)相組分比例時(shí)， 當(dāng)小比例組分的百分比例 X 小于等于 33%時(shí)，允許改變范圍為 0.7X 1.3X；當(dāng) X 大于 33%時(shí)，允許改變范圍為

9、X-10% X+10%。若需要用小粒徑（約2m）填充劑，輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測(cè)池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也應(yīng)作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。當(dāng)對(duì)其結(jié)果產(chǎn)生爭(zhēng)議時(shí)，應(yīng)以品種項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件的測(cè)定結(jié)果為準(zhǔn)。對(duì)于必須使用特定牌號(hào)的填充劑方能滿足分離要求的品種，可在該品種正文項(xiàng)下注明。1.2系統(tǒng)適用性試驗(yàn)精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)通常包括理論板數(shù)、分離度、靈敏度、重復(fù)性和拖尾因子等五個(gè)參數(shù)。按各品種項(xiàng)下要求對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行適用性試驗(yàn)， 即用規(guī)定的對(duì)照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)， 必要時(shí)，可對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，應(yīng)符合要求。2.1.1色譜柱的理論板

10、數(shù) (n)用于評(píng)價(jià)色譜柱的效能。 由于不同物質(zhì)在同一色譜柱上的色譜行為不同， 采用理論板數(shù)作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí)，應(yīng)指明測(cè)定物質(zhì)，一般為待測(cè)組分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的理論板數(shù)。在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間t R 和峰寬 (W)或半高峰寬 (Wh/2 ) ，按 n=16(t R/W)2 或 n=5.54 (t R/ Wh/2 ) 2 計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。 t R、W、 Wh/2 可用時(shí)間或長(zhǎng)度計(jì)（下同） ，但應(yīng)取相同單位。2.1.2 分離度 (R) 用于評(píng)價(jià)待側(cè)組分與相鄰共存物或難分離物質(zhì)之間的分離程度，是衡量色譜

11、系統(tǒng)效能的關(guān)鍵指標(biāo) . 可以通過測(cè)定待測(cè)物質(zhì)與已知雜質(zhì)的分離度，也可以通過測(cè)定待測(cè)組分與某一添加的指標(biāo)性成分 （內(nèi)標(biāo)物質(zhì)或其他難分離物質(zhì)）的分離度，或?qū)⒐┰嚻坊驅(qū)φ掌酚眠m當(dāng)?shù)姆椒ń到?，通過測(cè)定待測(cè)組分與某一降解產(chǎn)物的分離度，對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià)與調(diào)整。無論是定性鑒別還是定量測(cè)定， 均要求待測(cè)物質(zhì)色譜峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)色譜峰或特定的雜質(zhì)對(duì)照色譜峰及其他色譜峰與相鄰色譜峰之間有較好的分離度。除另有規(guī)定外，待測(cè)組分與相鄰共存物之間的分離度應(yīng)大于1.5 。分離度的計(jì)算公式為R=2(tR2一 t )/(W+W)R112或 R=2(t R2一 t R1)/1.70 (W 1.h/2 +W2.h/2 )式中， t

12、R2 為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間；t Rl 為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間； W1 、 W2及 W1.h/2、W2.h/2分別為此相鄰兩峰的峰寬及半高峰寬。當(dāng)對(duì)測(cè)定結(jié)果有異議時(shí)，色譜柱的理論板數(shù)(n) 和分離度 (R) 均以峰寬 (W)的計(jì)算結(jié)果為準(zhǔn)。2.1.3重復(fù)性用于評(píng)價(jià)連續(xù)進(jìn)樣后，色譜系統(tǒng)響應(yīng)值的重復(fù)性能。采用外標(biāo)法時(shí)，通常取各品種項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5 次，除另有規(guī)定外，其峰面精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%；采用內(nèi)標(biāo)法時(shí)，通常配制相當(dāng)于80%.100%和 120%的對(duì)照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3 種不同濃度的溶液，分別至少進(jìn)樣 2 次，計(jì)算平

13、均校正因子。其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。2.1.4拖尾因子（ T）用于評(píng)價(jià)色譜峰的對(duì)稱性。拖尾因子計(jì)算公式為：T=W0.05h /2d 1式中， W為 5%峰高處的峰寬； d 為峰頂在 5%峰高處橫坐標(biāo)平行線的投影0.05h1點(diǎn)至峰前沿與此平行線交點(diǎn)的距離。以峰高作定量參數(shù)時(shí)，除另有規(guī)定外，峰高法定量時(shí)T 應(yīng)在 0. 95 1.05之間。以峰面積作定量參數(shù)時(shí)， 一般的峰拖尾或前伸不會(huì)影響峰面積積分，但嚴(yán)重拖尾會(huì)影響基線和色譜峰起止的判斷和峰面積積分的準(zhǔn)確性，此時(shí)應(yīng)在各品種正文項(xiàng)下對(duì)拖尾因子作出規(guī)定。2.1.5靈敏度用于評(píng)價(jià)色譜系統(tǒng)檢測(cè)微量物質(zhì)的能力，通常以信噪比(S/N)來表示。通過測(cè)定一

14、系列不同濃度的供試品或?qū)φ掌啡芤簛頊y(cè)定信噪比。定量測(cè)定作業(yè)指導(dǎo)書指導(dǎo)書編號(hào) TYFDC-SOP-FF-028高效液相色譜法第 5 頁共 10頁第二版批準(zhǔn)李忠華初審吳雅凝起草郭欣時(shí)，信噪比應(yīng)不小于10；定性測(cè)定時(shí)，信噪比應(yīng)不小于 3。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中可以設(shè)置靈敏度實(shí)驗(yàn)溶液來評(píng)價(jià)色譜系統(tǒng)的檢測(cè)能力。1.3測(cè)定法1.3.1內(nèi)標(biāo)法按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各適量， 混合配成校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液。取一定量進(jìn)樣， 記錄色譜圖。測(cè)量對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算校正因子校正因子 (f)=(A s/c s )/(A R/c R)式中 As 為內(nèi)標(biāo)

15、物質(zhì)的峰面積或峰高; A R為對(duì)照品的峰面積或峰高; c s 為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度 ; c R為對(duì)照品的濃度。再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，測(cè)量供試品中待測(cè)成分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案含量 (cx)=f.Ax/(A s/c s)式中， Ax 為供試品峰面積或峰高； cx 為供試品的濃度； As 為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高； cs 為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度； f 為內(nèi)標(biāo)法校正因子。采用內(nèi)標(biāo)法，可避免因樣品前處理或進(jìn)樣體積誤差對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。1.3.2外標(biāo)法按各品種項(xiàng)下的規(guī)定， 精密稱 ( 量 ) 取對(duì)照品和供試品， 配制成溶液， 分別精密取一定

16、量， 進(jìn)樣，記錄色譜圖， 測(cè)量對(duì)照品溶液和供試品溶液中待測(cè)成分的峰面積或峰高 ) ，按下式計(jì)算含量含量 (Cx)=CR(Ax/A R)式中各符號(hào)意義同上。由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量， 當(dāng)采用外標(biāo)法測(cè)定供試品中成分或雜質(zhì)含量時(shí)，以手動(dòng)進(jìn)樣器定量環(huán)或自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣為宜。1.3.3加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，可采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法。在建立方法時(shí)，按各品種項(xiàng)下的規(guī)定， 精密稱 ( 量) 取待測(cè)物對(duì)照品和參比物質(zhì)對(duì)照品各適量，配作業(yè)指導(dǎo)書指導(dǎo)書編號(hào)TYFDC-SOP-FF-028高效液相色譜法第 6 頁共 10頁第二版批準(zhǔn)李忠華初審吳雅凝起草郭欣制待測(cè)物校正因子的溶液，

17、 進(jìn)樣，記錄色譜圖， 按下式計(jì)算待測(cè)物的校正因子。校正因子 (f)=(cA/A A)/(cB/A B)式中 cA 為待測(cè)物的濃度； AA為待測(cè)物的峰面積或峰高 ; ；cB 為參比物質(zhì)的濃度 ; ； AB 為參比物質(zhì)的峰面積或峰高。也可精密稱（量）取主成分對(duì)照品和雜質(zhì)對(duì)照品各適量， 分別配制成不同濃度的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖， 繪制主成分濃度和雜質(zhì)濃度對(duì)其峰面積的回歸曲線，以主成分回歸直線斜率與雜質(zhì)回歸直線斜率的比計(jì)算校正因子。校正因子可直接載人各品種項(xiàng)下， 用于校正雜質(zhì)的實(shí)測(cè)峰面積。 需作校正計(jì)算的雜質(zhì)，通常以主成分為參比， 采用相對(duì)保留時(shí)間定位， 其數(shù)值一并載人各品種項(xiàng)下。測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，

18、按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案度相當(dāng)?shù)娜芤?，作為?duì)照溶液， 進(jìn)樣，記錄色譜圖，必要時(shí)，調(diào)節(jié)縱坐標(biāo)范圍 （以噪聲水平可接受為 限）使對(duì)照 溶液的 主成分色 譜峰的峰高 約達(dá)滿 量程的10%-25%。除另有規(guī)定外，通常含量低于 0.5%的雜質(zhì)，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD) 應(yīng)小于 10%；含量在 0.5%2%的雜質(zhì)，峰面積的 RSD應(yīng)小于 5%；含量大于 2%的雜質(zhì)，峰面積的 RSD應(yīng)小于 2%。然后，取供試品溶液和對(duì)照品溶液適量，分別進(jìn)樣，除另有規(guī)定外，供試品溶液的記錄時(shí)間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時(shí)間的 2 倍，測(cè)量供試品溶液色譜圖各雜

19、質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，計(jì)算各雜質(zhì)含量。1.3.4不加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，若無法獲得待測(cè)雜質(zhì)的校正因子，或校正因子可以忽略，也可采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法。同上述 1.3.3 法配制對(duì)照溶液、 進(jìn)樣調(diào)節(jié)縱坐標(biāo)范圍和計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差后，取供試品溶液和對(duì)照溶液適量，分別進(jìn)樣。除另有規(guī)定外， 供試品溶液的記錄時(shí)間應(yīng)為主成分色譜峰保留時(shí)間的 2 倍，測(cè)量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積并與對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，依法計(jì)算雜質(zhì)含量。作業(yè)指導(dǎo)書指導(dǎo)書編號(hào)TYFDC-SOP-FF-028高效液相色譜法第 7 頁共 10頁第二

20、版批準(zhǔn)李忠華初審吳雅凝起草郭欣1.3.5面積歸一化法按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量進(jìn)樣，記錄色譜圖。測(cè)量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計(jì)算各峰面積占總峰面積的百分率。用于雜質(zhì)檢查時(shí)， 由于儀器響應(yīng)的線性限制，峰面積歸一化法一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查。4 注意事項(xiàng)4.1流動(dòng)相的制備與保存用高純度的試劑配制流動(dòng)相. 必要時(shí)照紫外一可見分光光度法進(jìn)行溶劑檢查，應(yīng)符合要求; 水應(yīng)為新鮮制備的高純水，可用超純水器制得或用重蒸餾水。 凡規(guī)定 pH值的流動(dòng)相， 應(yīng)使用精密 pH計(jì)進(jìn)行調(diào)節(jié)、 除另有規(guī)定外，偏差一般不超過±0.2pH 單位。配制好的流動(dòng)相應(yīng)通過適宜的0

21、.45 m（或 0.22 m ）濾膜濾過，以除去雜質(zhì)微粒。流動(dòng)相用前必須脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡， 影響泵的工作、 色譜柱的分離效率、 檢測(cè)器的靈敏度以及精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案基線穩(wěn)定性等。流動(dòng)相一般貯存于玻璃、 聚四氟乙烯等容器內(nèi)， 不能貯存在塑料容器中。 因許多有機(jī)溶劑如甲醇、 乙睛等可浸出塑料表面的增塑劑， 導(dǎo)致流動(dòng)相受污染。 貯存容器一定要蓋嚴(yán)， 以防止溶劑揮發(fā)引起組成變化， 也防止氧和二氧化碳溶人流動(dòng)相引起 pH 值變化，對(duì)分離或分析結(jié)果帶來誤差。磷酸鹽、醋酸鹽緩沖液容易發(fā)霉變質(zhì)，應(yīng)盡量新鮮配制使用。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在 3 天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新濾過。4.2溶液的配制

22、與保存除另有規(guī)定外，采用規(guī)定溶劑配制對(duì)照品溶液和供試品溶液，定量測(cè)定時(shí)， 對(duì)照品溶液和供試品溶液均應(yīng)分別配制兩份。 供試品溶液在注人液相色譜儀前，一般應(yīng)經(jīng)適宜的 0.45 m（或 0.22 m）濾膜濾過，以減少對(duì)色譜系統(tǒng)產(chǎn)生污染或影響色譜分離。 應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)要求和供試品的穩(wěn)定性， 設(shè)置待測(cè)溶液的貯存條件（如溫度、遮光等） 。4.3 色譜柱的使用 . 與保存根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和流動(dòng)相的 pH 值范圍，參照色譜柱說明書，選用適宜的色譜柱。 安裝色譜柱時(shí)應(yīng)使流動(dòng)相流路的方向與色譜柱標(biāo)簽上箭頭所示方向一致。 除另有規(guī)定外， 不宜反向使用， 否則會(huì)導(dǎo)致色譜柱柱效明顯作業(yè)指導(dǎo)書指導(dǎo)書編號(hào)TYFDC-SOP-FF-

23、028高效液相色譜法第 8 頁共 10頁第二版批準(zhǔn)李忠華初審吳雅凝起草郭欣降低，無法恢復(fù)。進(jìn)樣前，色譜柱應(yīng)用流動(dòng)相充分沖洗平衡。經(jīng)色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)測(cè)試，應(yīng)符合要求。色譜柱在使用過程中， 應(yīng)避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者機(jī)械震動(dòng)都會(huì)影響柱內(nèi)固定相的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流動(dòng)相流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行。試驗(yàn)結(jié)束后，可按色譜柱的使用說明書，對(duì)色譜柱進(jìn)行沖洗和保存。一般來講，對(duì)于反相色譜柱， 如使用緩沖液或含鹽溶液作為流動(dòng)相， 在試驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)用 10 倍柱體積 0 （如 150mm柱長(zhǎng)，約 15mL）的低濃度的甲醇 / 乙睛一水溶液（ 10

24、%-20%）沖洗，使色譜柱內(nèi)的鹽完全溶解洗脫出，再用較高濃度的甲醇 / 乙睛一水溶液（50%）沖洗，最后用高濃度的甲醇/ 乙臘一水溶液（ 80%-100%）沖洗，使色譜柱中的強(qiáng)吸附物質(zhì)沖洗出來。如色譜柱需長(zhǎng)期保存， 反相柱可以貯存于甲醇或乙睛中， 正相柱可以貯存于精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案經(jīng)脫水處理后的正己烷中， 離子交換柱可以貯存于含5%甲醇或含 0.05 疊氮化鈉的水中，并將色譜柱的兩端密封。以免于燥，室溫保存。4.4流動(dòng)相的調(diào)整為滿足色譜系統(tǒng)適用性要求，試驗(yàn)中有時(shí)需要調(diào)整流動(dòng)相組分的比例。在調(diào)整流動(dòng)相組分比例時(shí)，當(dāng)小比例組分的百分比例X 小于等于 33%時(shí)，允許改變范圍為0.7X 1.3X；當(dāng)

25、 X 大于 33%時(shí)，允許改變范圍為X-10%X+10%。下面舉例說明。4.4.1二元流動(dòng)相系統(tǒng)。例 1 兩組分比例為 50:50 按上述原則， X=50%， 33%該流動(dòng)相比例調(diào)節(jié)的范圍是 X-10%X+10%，即 40:60 至 60:40 。例 2 兩組分比例為 2:98 ， X=2%， 33%按上述原則， 2%的允許改變范圍為0.7X 1.3X ，即 1.4 2.6 故該流動(dòng)相比例調(diào)節(jié)的范圍是1.4:98.6 至 2.6:97.4。4.4.2三元流動(dòng)相系統(tǒng)例 3 三組分比例為 60:35:5 按上述原則，可每次調(diào)節(jié)流動(dòng)相系統(tǒng)中比例較低的兩個(gè)組分。對(duì) 35%的組分，其流動(dòng)相比例調(diào)節(jié)的范圍

26、是X-10% X+10%，即25%-45%，則流動(dòng)相系統(tǒng)比例的調(diào)節(jié)范圍是 50:45:5至 70:25:5 。作業(yè)指導(dǎo)書指導(dǎo)書編號(hào) TYFDC-SOP-FF-028高效液相色譜法第 9 頁共 10頁第二版批準(zhǔn)李忠華初審吳雅凝起草郭欣對(duì)于 5%的組分，其允許改變范圍為 0.7X 1.3X ，即 3.5% 6.5%，則流動(dòng)相系統(tǒng)比例的調(diào)節(jié)范圍是 58.5:35:6.5至 61.5:35:3.5。4.5 雜質(zhì)檢查時(shí)色譜參數(shù)的設(shè)置在進(jìn)行雜質(zhì)檢查時(shí)，選擇適宜的檢測(cè)靈敏度和設(shè)定適宜的積分參數(shù)非常重要。國(guó)內(nèi)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中， 通常制備與雜質(zhì)限度相當(dāng)濃度的對(duì)照溶液，用以調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使對(duì)照溶液的主成分色譜峰的峰高達(dá)滿量程的 10%5%，再進(jìn)行供試品溶液的測(cè)定，以峰面積計(jì)算單個(gè)雜質(zhì)量和總雜質(zhì)量。目前國(guó)內(nèi)色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)大致有積分儀和色譜工作站兩種類型， 對(duì)于傳統(tǒng)的積分儀，由于記錄儀的滿量程是固定的， 因此檢測(cè)靈敏度的調(diào)節(jié)通常是調(diào)節(jié)檢測(cè)器的靈敏度使色譜峰高達(dá)到記錄儀滿量程的某個(gè)范圍 ; 而對(duì)于色譜工作站，由于記錄標(biāo)尺的滿刻度是可調(diào)的， 所以通常是調(diào)節(jié)滿刻度的設(shè)定值， 使色譜峰的量程占滿刻度的某個(gè)范圍。精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案無論使用的是積分儀，或者是色譜工作站，如質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中沒有明確規(guī)定峰面積的取舍限值， 或沒有設(shè)定靈敏度測(cè)試溶液， 則在實(shí)際檢驗(yàn)中， 實(shí)驗(yàn)者通常根據(jù)以往經(jīng)