戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)區(qū)基因ORF2在Pichiapastoris中的分泌表達(dá)

1、戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)區(qū)基因ORF2在Pichiapastoris中的分泌表達(dá)戊型肝炎是近年來被發(fā)現(xiàn)的一種較為嚴(yán)重的新型肝炎，經(jīng)消化道傳播，世界各地均有流行，戊型肝炎疫苗是預(yù)防和控制其流行的有效手段之一，而基因工程抗原作為候選疫苗有很好的應(yīng)用前景。已被證實，戊型肝炎病毒（HEV）結(jié)構(gòu)區(qū)基因ORF2編碼蛋白具有較強(qiáng)的免疫學(xué)活性。HEV基因工程抗原的研制主要集中于ORF2上。目前，ORF2基因已成功在原核細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞中得到表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物均有一定免疫原性1。酵母表達(dá)系統(tǒng)以其表達(dá)產(chǎn)物類似于天然蛋白、能保持很好的生物學(xué)活性、表達(dá)條件易于控制、易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)勢作為疫苗研制的載體已被成功應(yīng)用。但國內(nèi)外尚未見

2、應(yīng)用酵母系統(tǒng)表達(dá)戊型肝炎ORF2的報道。為探討戊型肝炎基因工程疫苗生產(chǎn)的新途徑，我們利用甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)了HEV ORF2基因，并對相關(guān)問題進(jìn)行了討論。 1材料和方法1.1質(zhì)粒、菌株及酵母表達(dá)系統(tǒng)試劑質(zhì)粒pPIC9K,酵母菌株GS115，GS115 Albumin,GS115-gal, 大腸埃希菌TOP10F等均購自美國Invitrogen 公司的多拷貝巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)試劑盒，其他試劑均按試劑盒說明進(jìn)行配制。1.2工具酶與試劑限制性內(nèi)切酶SnaB,Bg1，Not等均為New England Biolabs公司產(chǎn)品。Klenow 酶，Taq DNA聚合酶，T4DNA連接酶均為

3、Promega公司產(chǎn)品。HEV ORF2單克隆抗體為本室制備，戊型肝炎陽性患者血清來自臨床戊型肝炎病人，經(jīng)血清學(xué)檢測證實HEV IgG陽性的患者。重組HEV ORF2基因工程抗原為ORF2基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)產(chǎn)物，由本室制備2。1.3HEV ORF2基因克隆PCR引物參考我國戊型肝炎病毒基因組cDNA序列3設(shè)計，由中科院微生物所合成。上游引物5-cgtacgtaGCGGTCGCTCCGGCCCATG-3,引入SnaB位點。下游引物5-ataagaatgcggccgCTATAACTCCCGAG-3,引入Not位點。PCR擴(kuò)增ORF2基因112-660氨基酸，全長1.65 kb。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)

4、Klenow酶補(bǔ)平回收，SnaB和Not酶切處理后與經(jīng)相應(yīng)酶切處理的pPIC 9K載體連接，轉(zhuǎn)化。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，篩選其中一株陽性克隆經(jīng)ABI 377A型DNA測序儀進(jìn)行序列測定，命名為pPIC9K ORF2。1.4轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子將pPIC9K ORF2,pPIC9K質(zhì)粒經(jīng)Bg1酶切線性化處理，以電轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)化GS115，轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂于MD平皿上，經(jīng)30培養(yǎng)2 d后將生長的His陽性克隆用滅菌雙蒸水懸浮，按每平皿1105細(xì)胞涂于含G418不同濃度的YPD平皿，其中G418含量分別為0，1.0,2.0,3.0,4.0 mg/ml。繼續(xù)30培養(yǎng)35 d后，G418抗性克隆長出。1.5

5、表型檢測與誘導(dǎo)表達(dá)將G418高抗性克隆分別在MD和MM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，篩選Muts的克隆接種于5 ml BMGY培養(yǎng)基中，30培養(yǎng)36 h后離心棄上清，細(xì)胞沉淀中加入1.5 ml BMMY培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3 d，并于每24 h補(bǔ)充甲醇，維持其終濃度0.5%。誘導(dǎo)結(jié)束后將菌液離心，取上清進(jìn)行ELISA及SDS-PAGE電泳檢測。1.6ELISA檢測表達(dá)產(chǎn)物活性建立雙夾心ELISA法檢測表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)活性。步驟如下:包被小鼠抗-HEVORF2單抗；加酵母分泌表達(dá)上清，以重組ORF2原核表達(dá)純化抗原作為陰性對照，單純載體誘導(dǎo)表達(dá)上清作為陰性對照；加HEV IgG抗體陽性患者血清；加HRP標(biāo)記抗人Ig

6、G抗體；加TMB底物顯色并終止。應(yīng)用酶標(biāo)分析儀測定ELISA反應(yīng)各孔吸光度A值（450 nm)。2結(jié)果2.1HEV ORF2基因克隆應(yīng)用PCR方法成功從HEV ORF2 cDNA中擴(kuò)增到約1.65 kb的DNA條帶，回收片段，連接于pPIC9K，重組質(zhì)粒經(jīng)相應(yīng)酶切鑒定，電泳條帶和預(yù)期設(shè)計相符。選擇一陽性克隆，DNA測序證實其序列和讀碼框架皆正確。2.2篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子及誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物分析應(yīng)用電轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)化效率很高，重組質(zhì)粒及載體對照轉(zhuǎn)化GS115后于MD平皿上皆有大量His陽性克隆產(chǎn)生，進(jìn)一步將這些克隆進(jìn)行G418篩選，發(fā)現(xiàn)G418在4.0 mg/ml濃度時仍有數(shù)百個克隆產(chǎn)生，經(jīng)表型檢測后，篩選表

7、型為Muts的克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，取表達(dá)上清直接進(jìn)行ELISA檢測，從約400株克隆中共篩選到若干株較高活性克隆，將這些陽性克隆劃單斑，挑取單克隆再誘導(dǎo)，直獲得較為穩(wěn)定表達(dá)的克隆。SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)這些克隆表達(dá)帶型不盡一致。表1顯示5株陽性克隆各挑取3個單菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后直接取表達(dá)上清進(jìn)行ELISA的檢測結(jié)果。從表1可以看出，利用甲醇營養(yǎng)型酵母系統(tǒng)表達(dá)的HEV ORF2抗原是特異的。3討論HEV ORF2 已被證實為編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因，在其5端含有一典型的信號肽序列，3包含了一個主要的免疫原性表位。因此從ORF2來源的基因工程抗原可以廣泛應(yīng)用于戊型肝炎病毒感染的診斷及疫苗研究?；谠思?xì)

8、胞表達(dá)的HEV ORF2已成功地應(yīng)用于戊型肝炎的診斷，但疫苗的研究尚未有突破進(jìn)展。Li等4于1997年報道，其將編碼HEV ORF2第112-660氨基酸的基因在昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，在培養(yǎng)基中得到以相對分子質(zhì)量50 000蛋白為主的HEV表達(dá)蛋白，并能自身裝配形成病毒樣顆粒（VLPs)。作者認(rèn)為，VLPs的形成可能成為很有前景的戊型肝炎重組疫苗。作為VLPs形成的必要條件之一，在基因結(jié)構(gòu)中ORF2 N端前111氨基酸必需刪除，這樣表達(dá)蛋白才能經(jīng)轉(zhuǎn)錄后修飾，被細(xì)胞蛋白酶降解繼而釋放到培養(yǎng)基中4。另外Yarbough等也有類似報道，其將112-660氨基酸編碼基因在昆蟲細(xì)胞表達(dá)時可以得到基

9、本均一的表達(dá)產(chǎn)物。純化的這種62 000可溶性蛋白作為免疫源對獼猴進(jìn)行免疫保護(hù)研究，結(jié)果免疫猴子能產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，抵抗HEV的攻擊5。由于昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)作為疫苗研制的載體尚未通過FDA批準(zhǔn)，而酵母表達(dá)系統(tǒng)在疫苗研制中已得到廣泛應(yīng)用，因此，我們試將ORF2基因編碼112-660氨基酸部分克隆到酵母分泌型載體，在巴氏畢赤酵母細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果令人鼓舞，通過改變陽性克隆的各種誘導(dǎo)條件，如pH值、誘導(dǎo)時間、甲醇濃度、不同培養(yǎng)基等，最終確定了獲得較高免疫活性的誘導(dǎo)條件，得到了分泌表達(dá)活性較高的克隆。為戊型肝炎的疫苗研制探索了一條新的途徑。表15個陽性表達(dá)菌株誘導(dǎo)表達(dá)上清ELISA檢測結(jié)果（A值）

10、Fig.1ELISA results of induced supernatants from 5 positively expressed strains (A value)菌株Strains陽性對照Positive control*陰性對照Negative controlHEV60HEV79HEV110HEV116HEV1821-2-3-平均值A(chǔ)verage *:陽性對照為重組HEV ORF2原核表達(dá)抗原，其濃度為2 g/ml*:Recombinant HEV ORF2 protein expressed in E.coli as positive control (2 g/ml) 本課題

11、由國家九五攻關(guān)課題基金資助（03-10-20）作者單位：佟玉品（中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所肝炎病毒研究室北京100052）畢勝利（中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所肝炎病毒研究室北京100052）張明程（中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所肝炎病毒研究室北京100052）魯健（中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所肝炎病毒研究室北京100052）詹美云（中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所肝炎病毒研究室北京100052）參考文獻(xiàn)1，Robison RA,Burgess WH,Emerson SU,et al. Structural characterization of recombinant hepatitis

12、 E virus ORF2 proteins in baculovirus-infected insect cell.Protein Express Purifi,1998,12:75-84.2，畢勝利，江永珍，趙洪蘭，等.戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)區(qū)抗原在大腸桿菌中的表達(dá)和分析.病毒學(xué)報,1996,12:118-120.3，畢勝利,劉崇柏,曹學(xué)義,等.我國戊型肝炎病毒基因組cDNA全序列測定及分析.病毒學(xué)報,1992,8:271-279.4，Li TC,Yamakawa,Y,Suzuki K,et al.Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus.J Virol,1997,71,7207-7213.5，Yarbough PO,Krawczyski K,Tam AW,et al. Prevention of hepatitis E using r62k sub