斑茅兩個(gè)看家基因片段的克隆及其在基因芯片中的應(yīng)用10.6

1、熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，（）：斑茅兩個(gè)看家基因片段的克隆及其在基因芯片中的應(yīng)用張積森，李偉，闕友雄，阮妙鴻，張木清，陳如凱（福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)部甘蔗生理生態(tài)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州；福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州）摘要：根據(jù)已發(fā)表的同源基因序列，利用技術(shù)分離了斑茅（）的和兩個(gè)看家基因片段，用它們作為芯片陽(yáng)性參照，以未經(jīng)聚乙二醇（）脅迫處理的斑茅葉片為對(duì)照，和脅迫的組材料同芯片進(jìn)行雜交分析。雜交結(jié)果顯示，雜交的與平均信噪比（，）分別為和，雜交的與平均信噪比分別為和，信噪比均很高；同時(shí)兩個(gè)看家基因的雜交都顯示出極強(qiáng)的信號(hào)，其中的雜交信號(hào)值大于，也在以上，雜交結(jié)果可靠。分析了脅的表達(dá)有明顯變化，而看家基

2、因表達(dá)均較穩(wěn)定。上述結(jié)果表明所克迫個(gè)時(shí)段與兩個(gè)看家基因的表達(dá)，隆的兩個(gè)看家基因在斑茅中表達(dá)量高，且脅迫下表達(dá)較為穩(wěn)定，是基因芯片理想的陽(yáng)性參照。關(guān)鍵詞：斑茅；看家基因；基因芯片；中圖分類號(hào)：文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：文章編號(hào)：（），（，；，）：（：）（：）（）（：），：；收稿日期：接受日期：基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（）；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（）資助通訊作者熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)第卷看家基因又稱持家基因（），是指所有細(xì)胞中組成型表達(dá)的一類基因，其產(chǎn)物是維持細(xì)胞各種基本生命活動(dòng)所必需的。甘油醛磷酸脫氫酶（，）和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（，）基因和是植物中兩個(gè)重要的看家基因。甘油醛磷酸脫氫酶廣泛

3、存在于各種生物的細(xì)胞中，是葡萄糖酵解和糖原異生代謝途徑中必不可少的酶，它催化甘油醛磷酸（）可逆的氧化和磷酸化，生成，二磷酸甘油酸（），是維持生命活動(dòng)最基本的酶之一，應(yīng)用作為熒光定量、或基因芯片的內(nèi)參基因在動(dòng)植物研究中已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用。而腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶是植物腺嘌呤磷代謝過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，它催化磷酸核糖焦磷酸（，）與腺嘌呤合成腺嘌呤磷酸（，）。李軍等克隆了水稻基因，并發(fā)現(xiàn)該基因在水稻的各個(gè)組織部位表達(dá)穩(wěn)定，表達(dá)量高，說明是一個(gè)可以利用的內(nèi)參基因，作為內(nèi)參基因在其它動(dòng)植物研究中也有報(bào)道。斑茅（）是甘蔗（）的近緣屬野生植物，具有高大粗壯、生長(zhǎng)直立、抗旱耐瘠、抗病性強(qiáng)、宿根性好、分蘗多、生長(zhǎng)快及

4、適應(yīng)性廣等優(yōu)良性狀，近二十年來越來越受到國(guó)內(nèi)外甘蔗育種界的重視。但對(duì)斑茅的研究主要集中于形態(tài)學(xué)、染色體變異和生理抗逆性等方面，為充分開發(fā)利用斑茅的優(yōu)良抗逆基因資源，利用基因芯片技術(shù)研究抗逆基因網(wǎng)絡(luò)、分離克隆重要功能基因并遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗是提高甘蔗抗逆性的重要手段，然而目前斑茅分子生物學(xué)研究缺乏有效的內(nèi)參基因信息。本研究擬利用方法，從斑茅上分離和兩個(gè)基因片段，并將這兩個(gè)看家基因克隆作為陽(yáng)性內(nèi)參的芯片同組脅迫的斑茅材料進(jìn)行雜交，分析其芯片雜交結(jié)果，以充分闡釋和兩個(gè)基因在各種不同脅迫下的表達(dá)強(qiáng)度及其穩(wěn)定性，探討斑茅和作為內(nèi)參基因的可行性，同時(shí)也為甘蔗及其近緣植物看家基因的克隆與應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。材料和方

5、法植物材料將采集于福建農(nóng)林大學(xué)校園內(nèi)的野生斑茅（）莖種植于高、直徑為的瓷盆沙子中，共盆，每盆種植株，平行進(jìn)行澆水和施肥以保證生長(zhǎng)一致，待株高長(zhǎng)至?xí)r，于玻璃溫室中進(jìn)行水分脅迫處理，盆正常供水，其余去除沙子后，放入水中恢復(fù)后，置于含的水中脅迫處理。分別剪取正常供水和經(jīng)的脅迫、的斑茅葉片，立即投入液氮中，然后保存于!冰箱。甘蔗福農(nóng)種植于高、直徑為的瓷盆沙子中，長(zhǎng)至高時(shí)，剪取葉片，立即投入液氮中，然后保存于!冰箱。生化試劑（）；限制性內(nèi)切酶（）；（）；試劑（）；（）和（），引物合成由上海生物生工工程有限公司完成；其它常規(guī)的分子生物學(xué)試劑購(gòu)自上海生工、廈門泰京及大連寶生物等公司。提取葉片總的提取按的試劑

6、盒說明書操作，取，用瓊脂糖變性膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。擴(kuò)增基因的引物參考玉米（，登錄號(hào)為：）基因的序列設(shè)計(jì)，引物序列為：；：；基因的引物也參考玉米的基因的序列（登錄號(hào)為：）設(shè)計(jì)，引物序列為：；：。每的反轉(zhuǎn)錄體系包括：倍的×緩沖液（，），（），的，（），第期張積森等：斑茅兩個(gè)看家基因片段的克隆及其在基因芯片中的應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄酶，總（）作為模板，用無的補(bǔ)足。!反應(yīng)，!，!保存。反應(yīng)體系的總體積為，包括：，×，的擴(kuò)增基因正、負(fù)鏈引物!變性后，加入（）聚合酶，用補(bǔ)足。循環(huán)反應(yīng)條件：!，!，!，最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后于!延伸，取用瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果。擴(kuò)增獲得的片段，從瓊脂糖凝膠上分離后連接于載體（）

7、。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆。選取陽(yáng)性克隆測(cè)序，測(cè)序工作由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。測(cè)序結(jié)果提交到核酸數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行比對(duì)分析。芯片與芯片的雜交與分析芯片的制作選取如下靶標(biāo)：和與含個(gè)文庫(kù)克隆片段（擬另文發(fā)表），長(zhǎng)度在之間。以為陰性對(duì)照，和作為陽(yáng)性對(duì)照，單純點(diǎn)樣溶液為空白對(duì)照。調(diào)整各靶基因濃度為。單個(gè)矩陣排布：×，文庫(kù)克隆矩陣內(nèi)重復(fù)次，共個(gè)亞矩陣，和的片段在每個(gè)亞矩陣內(nèi)一個(gè)，整個(gè)芯片分別有個(gè)重復(fù)，所用點(diǎn)樣儀為公司的（由上海生物芯片有限公司完成）。芯片進(jìn)行線性放大（線性放大具體方法參見試劑盒說明書）后，用標(biāo)記未經(jīng)處理的樣品為對(duì)照，分別標(biāo)記處理、的芯片，取對(duì)

8、照探針和試驗(yàn)組探針等量混合雜交芯片，每個(gè)雜交重復(fù)兩個(gè)芯片。雜交芯片使用獲取信號(hào)數(shù)據(jù)和雜交結(jié)果。將圖像導(dǎo)入圖像分析軟件，經(jīng)過自動(dòng)和人工定位排列，確定雜交點(diǎn)的范圍，過濾背景噪音，提取得到基因表達(dá)的熒光信號(hào)強(qiáng)度值，最后以列表形式輸出，從而完成將掃描得到的圖像定量轉(zhuǎn)化為數(shù)值。將數(shù)值導(dǎo)入分析軟件，用基于陰性參照的背景扣除法（）和基于點(diǎn)信號(hào)強(qiáng)度與片信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)化（）方法標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算得到值（兩種熒光與的比值），并提取和兩個(gè)克隆位點(diǎn)的和的信號(hào)值分別制作散點(diǎn)圖。結(jié)果和分析的質(zhì)量分析總在和波長(zhǎng)下測(cè)定值，值介于之間。用瓊脂糖變性膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。電泳結(jié)果顯示有清晰的、條帶，條帶不明顯（圖）。說明所提取的可以用于進(jìn)一步的

9、和芯片分析實(shí)驗(yàn)。圖斑茅總電泳圖基因片段的克隆以未經(jīng)脅迫處理的斑茅和甘蔗福農(nóng)的總反轉(zhuǎn)錄的為模板，用引物、進(jìn)行擴(kuò)增，獲得一個(gè)特異的目的基因片段（圖），同時(shí)對(duì)以斑茅為模板的產(chǎn)物經(jīng)克隆、測(cè)序分析，并進(jìn)行同源性比對(duì)，該片段長(zhǎng)（圖，登錄號(hào)為：）。與其它植物中的基因在氨基酸水平上具有較高的同源性，與玉米（，）的同源性為，與大麥（，）的為，水稻（，）的為，擬南芥（，）的為，馬鈴薯（，）的為，黃豆（，）的為，這說明所獲得的基因片段屬于基因。熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)第卷圖基因片段的電泳圖：；，：；，：圖斑茅基因片段序列下劃線部分為引物。圖基因片段序列下劃線部分為引物。芯片雜交結(jié)果分析以未經(jīng)脅迫處理為對(duì)照，將的脅迫處理、

10、的斑茅葉片分別進(jìn)行芯片雜交。從圖和圖可以看出，兩個(gè)看家基因都表現(xiàn)出極強(qiáng)的雜交信號(hào)，其中基因的雜交信號(hào)大于，基因的雜交信號(hào)也在以上。從張芯片的雜交結(jié)果顯示，基因片段雜交的與平均信噪比（，）分別為和，基因片段雜交的與平均信噪比（，）分別為和，說明雜交結(jié)果可靠。研究表明，甜菜堿脫氫酶（，）基因表達(dá)受水分脅迫誘導(dǎo)，選擇點(diǎn)于芯片的甜菜堿脫氫酶基因的片段進(jìn)行表達(dá)譜分析（圖）。在脅迫的表達(dá)受明顯抑制，而后表達(dá)呈明顯上調(diào)。這說明個(gè)時(shí)段的脅迫對(duì)斑茅的作用明顯。在處理的個(gè)時(shí)間梯度上（圖），和表達(dá)均無顯著差異（或），說明脅迫對(duì)兩個(gè)看家基因的表達(dá)影響不大。但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)有所上調(diào)，而的表達(dá)基本沒有變化。說明

11、兩個(gè)看家基因片段符合芯片陽(yáng)性參照的要求?；蚱蔚目寺∫晕唇?jīng)脅迫處理的斑茅和甘蔗福農(nóng)的總反轉(zhuǎn)錄的為模板，用引物、的擴(kuò)增目的基因，獲得一個(gè)特異的片段（圖）。同時(shí)對(duì)以斑茅為模板的產(chǎn)物經(jīng)克隆、測(cè)序分析，該片段長(zhǎng)（圖，登錄號(hào)為：）。與玉米（）基因的核酸序列比較，同源性為，比對(duì)分析結(jié)果表明，該序列為基因編碼框下游端序列。討論甘蔗與斑茅是近緣屬植物，根據(jù)玉米中的和基因設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，從斑茅和甘蔗中均能擴(kuò)增出目的片段。本項(xiàng)目組克隆的其它基圖片段的電泳圖：；，：；，：因也說明，甘蔗與斑茅在核酸水平上確實(shí)具有較高的同源性，如、基因（蔡秋華、張積森，私人通訊），其序列同源性可達(dá)第期張積森等：斑茅兩個(gè)看家基因片段的克

12、隆及其在基因芯片中的應(yīng)用圖的雜交信號(hào)散點(diǎn)圖圖的雜交信號(hào)散點(diǎn)圖，可以推測(cè)利用斑茅克隆對(duì)甘蔗進(jìn)行基因芯片表達(dá)譜分析是可行的，因而在挖掘甘蔗基因資源，參考其近緣屬植物的基因序列也同樣具有重要的意義。芯片技術(shù)應(yīng)用中，陽(yáng)性對(duì)照是進(jìn)行基因表達(dá)譜雜交質(zhì)量分析的重要參照物，也是評(píng)判基因熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)第卷圖脅迫后、的芯片表達(dá)，芯片雜交效果的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)大型芯片，其對(duì)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化可以不依賴于陽(yáng)性參照基因，不要求陽(yáng)性參照表達(dá)的完全穩(wěn)定，因而對(duì)陽(yáng)性參照的要求是表達(dá)量高、能反映芯片的雜交質(zhì)量，但允許一定程度的表達(dá)波動(dòng)。因此在陽(yáng)性參照選擇上，由于制備芯片的物種的基因表達(dá)差異，陽(yáng)性參照的選擇有所不同。在雜交后對(duì)芯片質(zhì)量的評(píng)

13、判中，雜交信噪比是一個(gè)重要的標(biāo)準(zhǔn)。本研究中所選用的兩個(gè)看家基因的芯片雜交信號(hào)散點(diǎn)圖均顯示出極強(qiáng)的信號(hào)值，這說明兩個(gè)看家基因的表達(dá)量大。組雜交結(jié)果中，克隆片段雜交的與平均信噪比分別為和，克隆片段雜交的與平均信噪比分別為和，雜交結(jié)果可靠，說明本試驗(yàn)所克隆的兩個(gè)基因作為芯片陽(yáng)性參照是可行的。進(jìn)一步分析還顯示，采用的看家基因在芯片表達(dá)上出現(xiàn)較小波動(dòng)，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)有上升的趨勢(shì)。這種現(xiàn)象在動(dòng)物研究中有較多的報(bào)道，在大鼠的肝、脾臟和腦，癌細(xì)胞浸潤(rùn)和沒有癌細(xì)胞浸潤(rùn)的人黑色素細(xì)胞，出生不同天數(shù)的兔子鞏膜中都已發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)不穩(wěn)定。在植物中，等的研究表明，毛葉垂頭菊（）的的和酶蛋白受和水分脅迫誘導(dǎo)表達(dá)；等報(bào)道了擬南芥（）種子的細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)與種子脫水程度有關(guān)；大麥的基因被認(rèn)為受鐵離子缺乏誘導(dǎo)，而水稻則受溫度誘導(dǎo)。雖然作為陽(yáng)參基因較少用，但本研究結(jié)果表明在脅迫下表達(dá)較穩(wěn)定，其表達(dá)與水分脅迫無明顯相關(guān)，說明基因也是一種理想的陽(yáng)參基因。參考文獻(xiàn)，：，（）：，：，：，（），：，（）：（沈萬寬）（甘蔗），（）：（），é，（）：，×，：（鄭雪芳），（張木清），（李奇?zhèn)ィ?，（）：（分子植物育種），（）：（）（肖鳳迥）（甘蔗），（）：（