我國(guó)部分地區(qū)HIV-1耐藥性毒株分子流行病學(xué)探討

1、我國(guó)部分地區(qū)HIV-1耐藥性毒株分子流行病學(xué)探討    內(nèi)容導(dǎo)讀： HIV耐藥性是指由于發(fā)生特定的病毒基因突變,導(dǎo)致病毒對(duì)藥物敏感性下降的現(xiàn)象。大量研究顯示,耐藥性與抗病毒治療效果之間存在明顯的相關(guān)性,在控制了血漿病毒載量、CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)和抗病毒治療歷史等因素以后,耐藥性是獨(dú)立的導(dǎo)致抗病毒治療失敗的因素。本研究通過(guò)對(duì)我國(guó)部分省份艾滋病病人的多次橫斷面研究,闡明在接受抗病毒治療后,HIV-1耐藥性毒株在不同時(shí)間點(diǎn)的發(fā)生和流行水平;以河南省某地的176名艾滋病患者為對(duì)象,通過(guò)5年的隊(duì)列研究,分析針對(duì)不同藥物的耐藥發(fā)生的可能時(shí)間、耐藥突變發(fā)生模式及其隨時(shí)間的演

2、變;了解在我國(guó)特有治療模式下主要流行毒株中存在的新型耐藥突變發(fā)生情況及pol區(qū)基因的多態(tài)性,終極為熟悉我國(guó)HIV-1耐藥毒株的發(fā)生和流行規(guī)律、了解耐藥性HIV-1毒株的分子進(jìn)化特征、豐富對(duì)耐藥相關(guān)突變的熟悉提供依據(jù)、為正確檢測(cè)耐藥毒株、提高艾滋病抗病毒治療效果奠定基礎(chǔ)。第一部分我國(guó)部分地區(qū)HIV-1耐藥性毒株流行的橫斷面研究2004年3月至2008年9月,以河南、河北、山東、北京、廣東、甘肅、寧夏及廣西8省市的艾滋病病人為研究對(duì)象,進(jìn)行多次橫斷面研究,其中河南連續(xù)監(jiān)測(cè)5年,河北、山東、廣西連續(xù)監(jiān)測(cè)3年,北京、廣東、甘肅連續(xù)監(jiān)測(cè)2年,寧夏監(jiān)測(cè)1年。通過(guò)病毒抑制率分析抗病毒治療的效果;使用RT-P

3、CR方法獲得pol區(qū)目的基因,提交序列到斯坦福大學(xué)HIV耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)獲得耐藥信息。共調(diào)查艾滋病患者1113名,累積研究2263人次,了解和掌握了抗病毒治療地區(qū)治療后病毒抑制和耐藥發(fā)生情況。主要結(jié)果如下:1.在監(jiān)測(cè)省份,除河南省外,艾滋病抗病毒治療均取得了良好的效果(病毒抑制率最高可達(dá)94.34),延緩了艾滋病的進(jìn)程;2.耐藥毒株在多個(gè)省份都有發(fā)生,但在河南呈高度流行趨勢(shì)(約65);3.河南耐藥監(jiān)測(cè)人群中,服藥依從性僅能維持75左右,依從性差是導(dǎo)致該地區(qū)耐藥毒株高發(fā)的直接原因;4.耐藥發(fā)生與抗病毒治療失敗之毒治療的艾滋病病人進(jìn)行了5年開放式隊(duì)列研究,通過(guò)分析不同時(shí)間點(diǎn)耐藥突變出現(xiàn)的先后順序、耐藥突

4、變發(fā)生和演變的模式等,分析在當(dāng)?shù)靥厥庵委熌Ｊ较?耐藥性突變發(fā)生發(fā)展的規(guī)律。隊(duì)列共納入173例艾滋病患者,隨訪了1085人次、6510人月,最多的隨訪10次。主要結(jié)果如下:1.服藥依從性保持在75左右的、使用AZT/DDI/NVP治療方案的艾滋病 間呈高度相關(guān)(OR=0.942),耐藥是導(dǎo)致抗病毒治療失敗的關(guān)鍵因素;5.應(yīng)加強(qiáng)治療監(jiān)管和抗病毒治療教育、提高服藥依從性,以延緩HIV-1耐藥的發(fā)生與流行,提高治療成功率。第二部分河南省HIV-1耐藥性毒株發(fā)生和流行的隊(duì)列研究當(dāng)前我國(guó)已經(jīng)開展了多次HIV耐藥的橫斷面研究,但是隊(duì)列研究還未幾,在世界范圍內(nèi)也比較少見(jiàn),而這樣的研究對(duì)于揭示耐藥的發(fā)生發(fā)展規(guī)律

5、是非常重要的。我們對(duì)河南省某鄉(xiāng)接受抗病毒治療的艾滋病病人進(jìn)行了5年開放式隊(duì)列研究,通過(guò)分析不同時(shí)間點(diǎn)耐藥突變出現(xiàn)的先后順序、耐藥突變發(fā)生和演變的模式等,分析在當(dāng)?shù)靥厥庵委熌Ｊ较?耐藥性突變發(fā)生發(fā)展的規(guī)律。隊(duì)列共納入173例艾滋病患者,隨訪了1085人次、6510人月,最多的隨訪10次。主要結(jié)果如下:1.服藥依從性保持在75左右的、使用AZT/DDI/NVP治療方案的艾滋病患者,針對(duì)NRTIs發(fā)生耐藥的時(shí)間中位數(shù)是抗病毒治療后10個(gè)月左右,耐藥發(fā)生高峰在治療后6-12個(gè)月;2.該監(jiān)測(cè)人群針對(duì)NNRTIs耐藥的發(fā)生時(shí)間中位數(shù)為治療后6.5個(gè)月,在治療后4-6個(gè)月耐藥突變發(fā)生率最高。3.首次發(fā)生的N

6、RTIs耐藥突變,早期(治療1年內(nèi))發(fā)生的60是單一位點(diǎn)突變,1年后以突變型形式出現(xiàn)的增多。NRTIs單一突變發(fā)生越晚,保持穩(wěn)定或發(fā)展為突變型的可能性越大,對(duì)耐藥的貢獻(xiàn)也越大。首次發(fā)生的NRTIs耐藥突變,假如是突變型,則多數(shù)導(dǎo)致中高度耐藥。隨治療時(shí)間的延長(zhǎng),突變型出現(xiàn)并導(dǎo)致中高度耐藥的概率呈上升趨勢(shì)。4.以單一位點(diǎn)形式出現(xiàn)的NNRTIs耐藥突變,K103N最多(32.3),Y181C(14.20)和G190A(13.40)次之,它們均可穩(wěn)定存在并導(dǎo)致對(duì)NNRTIs的高度耐藥。隨治療時(shí)間延長(zhǎng),以單一位點(diǎn)突變和突變型形式出現(xiàn)的NNRTIs耐藥突變逐漸增加,導(dǎo)致高度耐藥的可能性亦增加。5.NRTI

7、s單突變位點(diǎn)M41L、D67N、T215Y/F的使用與否對(duì)pol區(qū)基因序列的基因變異影響不大(F=0.003,P=0.7560.05),但藥物存在加快了對(duì)耐藥突變位點(diǎn)上一頁(yè) 1 2 3 4 5 下一頁(yè) 與K219Q/E/T相對(duì)穩(wěn)定,可在體內(nèi)穩(wěn)定存在6個(gè)月以上。突變型M41L/L210LW/T215Y、M41L/E44DE/T215Y、M41L/E44D/T69D/V118I/L210W/T215Y、D67N/K70R/T215Y/K219E、L210W/T215Y都比較穩(wěn)定。NNRTIs穩(wěn)定的單位點(diǎn)突變?yōu)镵103N、Y181C與G19

8、0A,6.HIV-1耐藥的發(fā)生與CD4、病毒載量具有高度相關(guān)性,即耐藥發(fā)生時(shí)CD4下降、病毒載量明顯上升。第三部分新型HIV-1耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)的篩選以往HIV-1耐藥檢測(cè)多數(shù)只針對(duì)藥物的結(jié)合區(qū),即只局限于蛋白酶與逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸密碼子300位以前。最新的研究提示,酶結(jié)合以外區(qū)域的基因突變也有可能對(duì)耐藥產(chǎn)生重要影響。在我國(guó),多種因素導(dǎo)致可能存在未被熟悉的HIV-1耐藥相關(guān)突變位點(diǎn),且我國(guó)還沒(méi)有針對(duì)RT區(qū)300位以外密碼子耐藥突變的研究。我們針對(duì)前期研究獲得的接受和未接受抗病毒治療的的971條HIV-1pol基因序列(其中354條是包含300位密碼子以外的RT全長(zhǎng)序列),首先進(jìn)行基因分型,然后分別

9、與相應(yīng)亞型的共享序列進(jìn)行逐個(gè)密碼子比對(duì),篩選在接受與未接受抗病毒治療的序列中存在明顯差異的突變位點(diǎn),然后再檢索該突變位點(diǎn)在數(shù)據(jù)庫(kù)中的收錄情況,確定該位點(diǎn)是否可能為新型耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)。主要結(jié)果如下:1.HIV-1B亞型治療與未治療人群序列中,蛋白酶抑制劑耐藥相關(guān)突變的發(fā)生率無(wú)明顯差異(F=0.875,P=0.5790.05),B亞型與CRF01_AE亞型治療人群中蛋白酶抑制劑耐藥突變的發(fā)生率亦無(wú)明顯性差異(F=0.058,P=0.5760.05),這與多數(shù)病人未使用蛋白酶抑制劑治療有關(guān);2.HIV-1B亞型治療與未治療序列中,藥物的使用與否對(duì)pol區(qū)基因序列的基因變異影響不大(F=0.003,

10、P=0.7560.05),但藥物存在加快了對(duì)耐藥突變位點(diǎn) 的選擇(F=19.008,P=0.0070.05)。HIV-1B亞型與CRF_01AE亞型pol區(qū)基因序列突變發(fā)生沒(méi)有明顯差異(F=2.497,P=0.0570.05)。3.HIV-1B亞型治療序列中,21個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)的發(fā)生率明顯高于未治療序列(F=19.008,P=0.0070.05)。治療序列中NRTIs的耐藥突變模式以TAMs和M184V為主,分別為48.7和12.1,其次為Q151M突變復(fù)合體(5.77);NNRTIs耐藥突變以K103N和Y181C為主。4.分析HIV-1B亞型治療與未治療序列中蛋白酶區(qū)密碼

11、子突變,通過(guò)與蛋白酶共享序列99個(gè)密碼子逐一核對(duì),發(fā)現(xiàn)2個(gè)突變(I13V和R57K)在兩組序列中有差異,R57K在未治療序列中出現(xiàn)的頻率明顯高于治療序列,I13V則相反。這2個(gè)位點(diǎn)可能都是多態(tài)性突變位點(diǎn)。5.將B亞型共享序列與相應(yīng)亞型治療序列和未治療序列逆轉(zhuǎn)錄酶全長(zhǎng)560個(gè)密碼子逐一比對(duì),發(fā)現(xiàn)21個(gè)突變位點(diǎn)在兩組人群中具有明顯性差異,3個(gè)突變位點(diǎn)(I135V、S162C、V245E)的發(fā)生率在未治療序列明顯高于治療序列,18個(gè)突變位點(diǎn)的發(fā)生率在治療序列中明顯高于未治療序列,其中有14個(gè)是報(bào)道較少且與耐藥相關(guān)性不明確的位點(diǎn)。6.將初步篩選的14個(gè)突變位點(diǎn)逐個(gè)與美國(guó)斯坦福大學(xué)HIV耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄

12、序列進(jìn)行比較,確定L238I、K366R、T369V、A371V、I375V可能是與抗病毒治療及耐藥相關(guān)的突變。7.逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)300位密碼子以后可能與耐藥相關(guān)的突變位點(diǎn)的發(fā)生率分別為:L238I為26.33、K366R為21.74、T369V為8.30、A371V為7.51、I375V為7.20。8.在我國(guó)以吸毒、性接觸為主要感染途徑的人群中,可能存在HIV-1毒株的新型重組模式,即CRF_BC重組毒株與B亞型的二次重組。9.HIV-1亞型分布1第二部分河南省HIV-1耐藥性毒株發(fā)生和流行的隊(duì)列研究41-81研究目的41材料和方法41-45結(jié)果45-77討論77-79結(jié)論79-81第三部分新型

13、HIV-1耐藥相關(guān)突變的篩選81-140前言81-83研究目的83材料與方法83-86結(jié)果86-124討論124-127結(jié)論127-129參考文獻(xiàn)129-140個(gè)人簡(jiǎn)歷140-141致謝141-142附錄1:不同地區(qū)HIV-1感染者亞型分布情況分析142- 與感染途徑密切相關(guān),以獻(xiàn)/輸血為主要感染途徑的人群主要以B亞型為主,而吸毒、性傳播途徑的人群亞型則較為豐富。HIV-1分布地域特征明顯,在河南、河北、山東等地區(qū)地區(qū)以B亞型為主,而在廣西則以CRF01_AE為主。【關(guān)鍵詞】：HIV-1耐藥突變模式新型耐藥突變【論文提綱】：· 英文縮略詞表5-6· 中文摘要6-9· 英文摘要9-14· 前言14-23· 第一部分我國(guó)部分地區(qū)HIV-1耐藥性毒株流行的橫斷面研究23-41· 研究目的23· 材料和方法23-30· 結(jié)果30-37· 討論37-39· 結(jié)論39-41· 第二部分河南省HIV-1耐藥性毒株發(fā)生和流行的隊(duì)列研究41-81· 研究目的41· 材料和方法41-45· 結(jié)果45-77· 討論77-79· 結(jié)論7