禽流感病毒(H5N1)血凝素特異性單克隆抗體的制備、鑒定及其

1、第一軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文禽流感病毒(H5N1血凝素特異性單克隆抗體的制備、鑒定及其ELISA捕獲法的建立姓名:廖志勇申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別:碩士專業(yè):免疫學(xué)指導(dǎo)教師:車小燕20070523 第一部分禽流感病毒抗原的制備與鑒定 A B C圖ll IFA鑒定昆蟲細(xì)胞表達(dá)的重組H5蛋白(x200 Fig.1-Immunofluorescenceidentificationofthe expression ofrecombinantH5protein in infected High Five insect cells(x200A:H5Bacmidtransfected Hi曲Five cells treate

2、d with standard H5antiserum:B:H5Bacmidtransfected High Five cells treated with standard H7/H9antiserum: C:High Five cells treated with standard H5antiserum 表達(dá)重組H5蛋白的Hi曲Five細(xì)胞,與禽流感病毒H5亞型標(biāo)準(zhǔn)抗血清作用呈特異的綠色熒光(圖l一1A,細(xì)胞膜和細(xì)胞漿均有著色,與H7亞型標(biāo)準(zhǔn)抗血清不結(jié)合(圖1,l B:Hi曲Five細(xì)胞與H9啞型標(biāo)準(zhǔn)抗血清也不結(jié)合,免疫熒光圖與H7亞型標(biāo)準(zhǔn)抗血清同,故略去。對(duì)照的正常High Five細(xì)

3、胞,與H5啞型標(biāo)準(zhǔn)抗血清不結(jié)合(圖ll C。3.2重組H5蛋白的SDSPAGE電泳和免疫印跡結(jié)果SDSPAGE電泳結(jié)果顯示,鶯組H5蛋白的含量在與Ni離子親和柱結(jié)合|j后存在差異。提示在桿狀病毒體系表達(dá)的重組H5蛋白帶有His標(biāo)記,能結(jié)合到Ni柱上,但經(jīng)自然或變性條件純化得到的產(chǎn)物中均有非目的蛋白存在,不能得到特異的重組H5蛋白(圖略。收集表達(dá)重組H5蛋白的High Five細(xì)胞,進(jìn)行超聲處理后取上清電泳并轉(zhuǎn)印,免疫印跡結(jié)果【81(圖l一2顯示該七清能與H5亞型標(biāo)準(zhǔn)抗血清及鼠源抗His單抗結(jié)合,在約66kDa處呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)條帶,表明在High Five細(xì)胞表達(dá)的重組H5蛋白分子量與預(yù)期大小一

4、致,且具有抗原性;由于重組H5蛋白構(gòu)象的原因,蛋白與Ni離子親和柱不結(jié)合,因此不能得到純化的蛋白,但SDSPAGE電泳結(jié)果顯示表達(dá)重組H5蛋白的High Five細(xì)胞超聲處理后的上清80%為目的蛋白,故將HighFive細(xì)胞超聲處理后的上清直接用于免疫動(dòng)物。6碩士學(xué)位論文 1:雞抗禽流感病毒H5亞型標(biāo)準(zhǔn)血清;2:雞抗禽流感病毒H7亞型標(biāo)準(zhǔn)血清;3:雞抗禽流感病毒H9亞型標(biāo)準(zhǔn)血清;4:小鼠抗his單抗;5:正常雞血清1:Chicken antiH5standard sera;2:Chicken antiH7standard sera;3:Chicken antiH9standard sera;4

5、:Mouse antihis mAb;5:Normal chicken sera33重組H5蛋白及天然H5血凝素的血凝滴度測(cè)定血凝試驗(yàn)結(jié)果顯示,正常Hi曲Five細(xì)胞超聲上清以及PBS對(duì)照均不使豚鼠紅細(xì)胞發(fā)生凝集,而重組H5蛋白能使豚鼠紅細(xì)胞發(fā)生凝集,血凝滴度達(dá)l:128;三個(gè)批次的天然H5血凝素的血凝滴度則分別為l:l024、l:l024和1:256。 圖1-3pVAXl一tpA-97一H5質(zhì)粒酶切鑒定Fig.13Identification ofplasmid pVAXltpA一97一H5 l:pVAXl一tpA-97一H5digested by Kpn I(3.5and1.2kb;2:p

6、VAXl一tpA-97一H5 digested by Hind m(4.7kbl:3:lkb DNA Ladder7第一部分禽流感病毒抗原的制備與鑒定H5基因的質(zhì)粒經(jīng)Kpn I酶切釋放3.5kb和1.2kb大小片段,經(jīng)Hind III酶切得到4.7kb線性化質(zhì)粒,通過分析pVAXl.tpA一97一H5質(zhì)粒核酸序列中的酶切位點(diǎn),證實(shí)該結(jié)果與預(yù)期相符,見圖l一3。3.5對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的Xgal染色鑒定xgal染色結(jié)果(圖1.4顯示,帶有LacZ報(bào)告基因的對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,加入X.gal染液反應(yīng)后,圖A和B視野中分別有約30%和20%細(xì)胞呈特異性藍(lán)色,表明LacZ基因經(jīng)質(zhì)粒載體lz啟動(dòng)

7、子激活后,成功表達(dá)B一半乳糖苷酶,與底物x唔al反應(yīng)顯色,而A和B的區(qū)別在于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的量不同,分別為3嶺和l峙,而正常293細(xì)胞均尤顯色。結(jié)果表明pVAXI真核表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染效率較高。 A B C圖l_4攜帶報(bào)告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的x-gal染色鑒定Fig.144Xgal staining analysis ofthe p-gaiactosidaseexpression of293cells transfected by the control plasmid with reporter geneA、B:plasmid with Bgalactosidase gene-transfect

8、ed293cells treated withXgal(x200;C:control293cells treated with Xgai(x200、IFA結(jié)果(圖l一5顯示,H5基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的293細(xì)胞加入H5N1病毒免疫的雞血清后,視野中大部分細(xì)胞的胞膜及胞漿均出現(xiàn)特異性的綠色熒光,而正常293細(xì)胞均呈陰性染色,表明H5基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后表達(dá)的H5血凝素能與H5N1病毒免疫血清特異性結(jié)合,具有較好的抗原性,可用于免疫動(dòng)物。碩士學(xué)位論文 A B圖l一5IFA鑒定H5基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞上H5血凝素表達(dá)Fig.15Immunofluoresc2nce assayoftheH5hema

9、gglutinin expressionof293cellstransfected by plasmid pVAXl一tpA-97一H5A:pVAXl一tpA一97一H5plasmid-transfected293cells treated with H5N1 virus-immunized fowl serum(x200.B:293cells treated with H5N1virusimmunizedfowl serum(x2004討論本部分研究的目的是制備H5NI禽流感病毒血凝素抗原,用于免疫動(dòng)物。血凝素抗原的制備有多種方法,為了使獲得的抗原盡可能地接近自然狀態(tài)下的血凝素,同時(shí)考慮到安

10、全性及操作的簡(jiǎn)便性,實(shí)驗(yàn)中選擇了商品化粗提抗原、DNA質(zhì)粒以及基因重組蛋白共三種形式的血凝素抗原。1.利用速度梯度離心得到病毒天然抗原的方法較為簡(jiǎn)便,但滅活處理對(duì)病毒抗原性質(zhì)有無影響尚不明確。對(duì)獲得的3個(gè)批次天然H5血凝素進(jìn)行血凝滴度測(cè)定,其血凝效價(jià)最高達(dá)到1:1024,表明滅活處理后的天然H5血凝素保持了良好的血凝活性,提示病毒抗原與血凝活性相關(guān)的抗原決定簇保存完好,有助于誘導(dǎo)產(chǎn)生具有血凝抑制活性的抗體。2.攜帶H5血凝素基因的DNA質(zhì)粒對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境沒有危險(xiǎn)性,可用于制備針對(duì)某一亞型血凝素的特異性抗體91,但其免疫效果仍受質(zhì)粒載體、免疫佐劑等因素的影響“”。本研究制備了攜帶H5全長(zhǎng)基因的

11、真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXltpA一97一H5作為免疫原。Xgal染色試驗(yàn)表明攜帶報(bào)告基因的pVAXI真核表達(dá)載體具有良好的轉(zhuǎn)染效率,有利于外源基因的表達(dá)。免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果證實(shí),pVAXI.tpA-97一H5轉(zhuǎn)染后的表達(dá)產(chǎn)物能與H5N1病毒免疫血清特異性結(jié)合,提示H5基因的質(zhì)粒具有良好的抗原性。9 第三部分禽流感病毒Hj抗原檢測(cè)方法的建立 幽3一l10組有血凝抑制活性的單抗配對(duì)檢測(cè)不同稀釋度的天然H5血凝素Fig.3-1The detection of H5hemgglutinin by ten matched pairs of hemagglutination inhibitionmAbsTab.

12、3-1The detectionof six strains ofH5N1virusesbytenmatched pairs ofhemagglutinationinhibition mAbs碩士學(xué)位論文以H5M9和H5M11-HRP分別作為捕獲單抗和測(cè)定單抗建立雙單抗夾心捕獲抗原ELISA,經(jīng)方陣滴定法確定,捕獲抗體的包被濃度為20pg/ml,HRP.酶標(biāo)抗體工作濃度為1:500時(shí)較好。以上述方法,檢測(cè)梯度稀釋的天然H5血凝素和H5N1病毒液,以及作為陰性對(duì)照的稀釋液。結(jié)果顯示,上述雙抗體夾心抗原捕獲ELISA的檢測(cè)靈敏度較好,檢測(cè)天然H5血凝素和H5N1病毒液A/Vietnam/3028/04時(shí)的最低檢測(cè)限約為1/32血凝單位,見圖32。 圖3-2有血凝抑制活性單抗為基礎(chǔ)的雙抗體夾心抗原捕獲ELISA檢測(cè)天然H5血凝素和H5NI病毒液Fig.3-2Standard cnlve and detection limit ofdouble antibody sandwich c印ture ELIS