西羅莫司高產(chǎn)突變株FC904-33

1、西羅莫司高產(chǎn)突變株FC904-33                           作者：黃捷 金東偉 余輝 程元榮【摘要】  西羅莫司是吸水鏈霉菌FC904產(chǎn)生的新型強(qiáng)效免疫抑制劑。為了獲得高產(chǎn)西羅莫司突變株，采用UV、硝苯胍和甲基磺酸乙酯誘變劑誘變處理吸水鏈霉菌FC904的孢子懸液和發(fā)芽孢子，隨后用西羅莫司對(duì)存

2、活菌株進(jìn)行自身代謝產(chǎn)物的耐受性試驗(yàn)，獲得西羅莫司高產(chǎn)突變株FC904-33，其生物合成能力是原出發(fā)菌株的4.6倍。本文報(bào)道該突變株的培養(yǎng)特征、對(duì)抗生素的敏感性、西羅莫司生產(chǎn)能力和副產(chǎn)物等。 【關(guān)鍵詞】  西羅莫司； 誘變育種； 生物合成    ABSTRACT  Sirolimus, a powerful immunosuppressant, is produced by Streptomyces hygroscopicus FC904. In an attempt to improve its production, mutation and

3、 screening were carried out. Spore suspensions and the forming buds were treated with UV, nitrosoguanidine (NTG) and ethylmethane sulfonate (EMS), some of survivors were selected and detected their resistance to sirolimus. A mutant FC904-33 with higher productivity of sirolimus was obtained and the

4、features of the mutant such as fewer by-products and the susceptibilities to antibiotics as well as its cultural characteristics were presented.    KEY WORDS  Siroliums;  Mutagenesis;  Biosynthesis    西羅莫司(sirolimus)原名雷帕霉素(rapamycin)，是吸水鏈霉菌產(chǎn)生的具獨(dú)特作用機(jī)制的含氮三烯

5、大環(huán)內(nèi)酯化合物，具有抗真菌、抗增殖和抗腫瘤活性的新型強(qiáng)效免疫抑制劑。由于其特異地結(jié)合并抑制哺乳動(dòng)物類雷帕霉素靶蛋白(manmalian target of rapamycin，mTOR)的作用，已被用作器官移植抗排斥藥物、自身免疫性疾病治療藥1，臨床心血管支架涂料；西羅莫司及其的衍生物CCI-779、AP23573和RAD001正開發(fā)為靶向、低毒的抗腫瘤藥物2。論文論文參考網(wǎng)在生產(chǎn)過程中，西羅莫司菌種的生產(chǎn)能力是關(guān)鍵。本文報(bào)道應(yīng)用物理、化學(xué)誘變因子聯(lián)合誘變西羅莫司產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌FC9043孢子懸液和發(fā)芽孢子，存活株再行對(duì)其自身代謝產(chǎn)物西羅莫司耐藥性選擇和營(yíng)養(yǎng)代謝研究，獲得突變株33#以及突變

6、株33#的培養(yǎng)特征、抗生素敏感性及發(fā)酵調(diào)控。1  材料與方法    1.1  菌種    西羅莫司產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopcus)FC904，福建省微生物研究所保存，作為誘變育種的出發(fā)菌株。    1.2  培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件    (1)瓊脂斜面培養(yǎng)物  瓊脂斜面培養(yǎng)基為燕麥片瓊脂(ISP3)；自吸水鏈霉菌FC904沙土保存管中取出少許保存物或自生長(zhǎng)好的瓊脂斜面取出一環(huán)培養(yǎng)物接種于ISP3瓊脂斜面上

7、，28培養(yǎng)1520d，斜面表面培養(yǎng)物出現(xiàn)吸水黑斑，4保藏備用。    (2)種子培養(yǎng)  吸水鏈霉菌FC904孢子接種于種子培養(yǎng)基(主要成分有葡萄糖，酵母浸膏、蛋白胨等，pH7.0，500ml三角瓶裝80ml培養(yǎng)基)，28、220r/min振蕩培養(yǎng)3648h。種子瓶外觀濃稠， 顯微鏡觀察菌絲呈網(wǎng)狀，可作為移種的種子。    (3)發(fā)酵  36ml的種子培養(yǎng)物移入60ml發(fā)酵培養(yǎng)基中(主成分為：葡萄糖、淀粉、黃豆餅粉、蛋白胨等，pH6.0，三角瓶500ml)，28、220r/min振蕩培養(yǎng)8496h，進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。&#

8、160;   1.3  西羅莫司的檢測(cè)    (1)標(biāo)準(zhǔn)品  西羅莫司標(biāo)準(zhǔn)品由福建省微生物研究所制備，經(jīng)中國藥品生物制品檢定所標(biāo)定，純度99.8%。    (2)發(fā)酵液提取  發(fā)酵液經(jīng)甲醇提取后2進(jìn)行生物效價(jià)測(cè)定和/或HPLC檢測(cè)。    (3)生物效價(jià)檢測(cè)  生物效價(jià)檢測(cè)采用紙片半固體瓊脂擴(kuò)散法3。    (4)HPLC檢測(cè)  HPLC檢測(cè)采用外標(biāo)法。HPLC檢測(cè)儀：Beckman System Gold

9、，色譜柱：ODS C18，流動(dòng)相：甲醇水(7525)，檢測(cè)波長(zhǎng)277nm，柱溫40。    西羅莫司效價(jià)=標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣品積分面積(tran+cis)×進(jìn)樣體積/標(biāo)準(zhǔn)品積分面積(tran+cis)×進(jìn)樣體積    1.4  物理、化學(xué)誘變因子聯(lián)合處理吸水鏈霉菌FC904    (1)UV和NTG聯(lián)合處理吸水鏈霉菌FC904孢子  10ml孢子懸液置于9cm直徑的培養(yǎng)皿中，在暗環(huán)境下經(jīng)30W(2537?_)紫外燈、20cm距離照射10s后，再用NTG 3mg

10、/ml(0.1mol/L Tris?Cl pH8.0緩沖液配制)28避光處理23h。終止反應(yīng)后，孢子懸液重新懸浮于生理鹽水中，稀釋并涂布在ISP3瓊脂平板上，28培養(yǎng)1015d。論文參考網(wǎng)    (2)EMS處理突變株27#發(fā)芽孢子和西羅莫司抗性菌株的篩選  將處理獲得的突變株27#孢子接種于發(fā)芽培養(yǎng)基(葡萄糖1%，酵母浸膏0.6%，蛋白胨0.6%，K2HPO4?3H2O 0.1%，MgSO4?7H2O 0.05%，pH7.0，250ml三角瓶裝30ml培養(yǎng)基)，28，220r/min振蕩培養(yǎng)1820h，顯微鏡觀察有逗號(hào)狀芽頭，10000r/min離心1

11、0min，棄上清液，收集發(fā)芽孢子，用0.1mol/L、pH7.0的磷酸緩沖液洗滌，最后懸浮在含EMS 0.5mol/L的0.1mol/L、pH7.0的磷酸緩沖液中，28作用4h。5000r/min離心5min，去除含EMS的清液。采用稀釋法終止反應(yīng)后，發(fā)芽孢子移入與收集發(fā)芽孢子時(shí)等體積的上述發(fā)芽培養(yǎng)基中，繼續(xù)在28振蕩培養(yǎng)24h。離心收集菌絲體，懸浮于生理鹽水中。超聲波(型號(hào)：Siniprep150)破碎(置冰中，每次1min，間隔30s，共15min)至菌絲出現(xiàn)較均勻斷枝，不同稀釋度的這樣處理液分別涂布于ISP3瓊脂平板和含西羅莫司350450g/ml的ISP3瓊脂平板上，28培養(yǎng)1015d

12、。    1.5  抗生素的敏感性    采用固體瓊脂二倍稀釋法，培養(yǎng)基為ISP3瓊脂，28培養(yǎng)10d觀察結(jié)果。    1.6  3L自動(dòng)發(fā)酵罐發(fā)酵驗(yàn)證    采用美國NBS BIOFLU3000發(fā)酵罐進(jìn)行。斜面孢子接入種子培養(yǎng)基，于28、220r/min振蕩培養(yǎng)3648h后以10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，28、11的通氣量發(fā)酵8496h進(jìn)行西羅莫司效價(jià)檢測(cè)(HPLC)。發(fā)酵過程溶氧設(shè)置在40%，以攪拌轉(zhuǎn)速來維持設(shè)定的溶氧值，攪拌轉(zhuǎn)速控制在100400r/m

13、in之間。    2  結(jié)果    2.1  誘變處理    (1)UV和NTG對(duì)吸水鏈霉菌FC904的誘變處理  UV照射10s后用3mg/mlNTG處理吸水鏈霉菌FC904孢子懸液3h，致死率達(dá)99.2%。在挑取的2050株存活株中獲得70株發(fā)酵水平較出發(fā)菌株提高20%以上的菌株(生物檢定)，經(jīng)過進(jìn)一步篩選，獲得5株發(fā)酵水平較出發(fā)株高50%以上的菌株(HPLC檢測(cè))，其中突變株27#的發(fā)酵水平約是出發(fā)菌株的2倍。    (2)EMS對(duì)突變株2

14、7#的誘變處理  0.5mol/L EMS處理突變株27#的發(fā)芽孢子，在ISP3瓊脂分離平板和含西羅莫司ISP3的瓊脂平板上分別挑取528株和242株存活株進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示比出發(fā)菌株效價(jià)高20%以上(生物檢測(cè))的菌株分別有21株和23株；經(jīng)過進(jìn)一步的篩選并采用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，在ISP3瓊脂平板上挑取的菌株發(fā)酵效價(jià)均不高于出發(fā)株，而在含西羅莫司的ISP3瓊脂平板上挑取的菌株中有4株的效價(jià)較出發(fā)菌株提高50%。經(jīng)傳代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)突變株33#發(fā)酵效價(jià)高(HPLC檢測(cè)，表1)，組分較單一，性狀穩(wěn)定，生長(zhǎng)快，孢子豐滿。    2.2  高產(chǎn)突變株33#

15、的性狀研究    (1)菌落形態(tài)  在ISP3瓊脂平板上，與出發(fā)菌株相比，突變株的菌落形態(tài)發(fā)生明顯的變化。原出發(fā)菌株吸水鏈霉菌FC904菌落平坦，粉白色，平均直徑56mm，背面無色素；突變株27#菌落高起，呈圓形多皺褶， 平均直徑34mm， 背面無色素， 表面常出現(xiàn)白色表1    突變株與出發(fā)株的發(fā)酵水平比較的氣生菌絲蒙面； 突變株33#菌落平坦，平均直徑56mm，同心圓形，背面可見淺粉紅色色素。    (2)出發(fā)菌株吸水鏈霉菌FC904與突變株的發(fā)酵產(chǎn)物和生產(chǎn)能力比較  吸水鏈霉菌F

16、C904在沉沒培養(yǎng)中，西羅莫司發(fā)酵效價(jià)低，還產(chǎn)生西羅莫司發(fā)酵過程常見的副產(chǎn)物洋橄欖素5。HPLC檢測(cè)表明，突變株33#不但西羅莫司合成能力明顯提高分別是突變株27#的2.4倍和出發(fā)菌株吸水鏈霉菌FC904的4.6倍(表1)，而且發(fā)酵液中洋橄欖素含量極微，組分比較單一(圖1)。    (3)突變株33#的穩(wěn)定性考察  表2結(jié)果顯示，菌株孢子瓊脂斜面保存3個(gè)月，發(fā)酵效價(jià)無明顯變化。    (4)抗生素敏感性試驗(yàn)  將鏈霉素、慶大霉素等抗生素應(yīng)用于大環(huán)內(nèi)酯化合物產(chǎn)生菌(特別是西羅莫司產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌FC904)的選育已得

17、到肯定的結(jié)果6，7。我們考察了突變株27#和33#對(duì)不同化學(xué)類群的五種抗生素的敏感性，結(jié)果表明，效價(jià)高、副產(chǎn)物少的突變株33#對(duì)兩種氨糖抗生素的敏感度高于出發(fā)菌株吸水鏈霉菌FC904和突變株27#；對(duì)西羅莫司耐受性，突變株33#高于其他兩個(gè)出發(fā)菌株；對(duì)絲裂霉素和利福平，與吸水鏈霉菌FC904和突變株27#有近似的結(jié)果(表3)。    2.3  3L自動(dòng)發(fā)酵罐的發(fā)酵    圖2顯示突變株33#在3L自動(dòng)發(fā)酵罐的發(fā)酵參數(shù)。突變株33#糖、氮代謝正常； 西羅莫司合成始于40h，發(fā)酵至88h西羅莫司合成達(dá)到最高值。在發(fā)酵過 

18、;   A：吸水鏈霉菌FC904；  B：突變株27#；  C：突變株33#。      SRL：西羅莫司；  cis：順式異構(gòu)體；  trans：反式異構(gòu)體表2      突變株33#斜面保存時(shí)間的穩(wěn)定性考察表3    西羅莫司出發(fā)菌株和突變株對(duì)抗生素的敏感度程中，隨菌絲生長(zhǎng)，pH大幅度下降，在西羅莫司合成期維持在一個(gè)較低值，發(fā)酵后期略有回升；菌絲生長(zhǎng)期對(duì)氧的需求較高，攪拌轉(zhuǎn)速維持在最高設(shè)定值的400r/

19、min，而西羅莫司合成期對(duì)氧的需求相對(duì)較低，到后期維持在較低水平(200r/min左右)。    3  討論    關(guān)于西羅莫司菌種的選育，我們?cè)鴪?bào)道氨基糖苷類抗生素用于西羅莫司菌種選育中取得的結(jié)果，應(yīng)用NTG處理吸水鏈霉菌FC904原生質(zhì)體后在含慶大霉素1g/ml的溶液中再處理得到西羅莫司合成能力比吸水鏈霉菌FC904高129%的突變株C14-26。 本文采用物理和化學(xué)誘變劑聯(lián)合處理吸水鏈霉菌FC904孢子和發(fā)芽孢子，再通過耐自身代謝產(chǎn)物西羅莫司進(jìn)行篩選獲得一株較為優(yōu)良的突變株33#；該菌株生物合成西羅莫司的能力是原始出發(fā)

20、菌株吸水鏈霉菌FC904的4.6倍，突變株27#的2.4倍。該菌株在菌落形態(tài)等方面的性狀與前兩代菌株不同；在發(fā)酵代謝產(chǎn)物上，新菌株極少合成西羅莫司發(fā)酵時(shí)常見的副產(chǎn)物洋橄欖素，使下游的提取、純化步驟更快捷、方便；此外，新菌株的斜面孢子穩(wěn)定性好，F(xiàn)1代斜面在4保存3個(gè)月效價(jià)基本穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)的需要。以上結(jié)果在3L自動(dòng)發(fā)酵罐上得到了驗(yàn)證。產(chǎn)生菌的選育是繁重而細(xì)心的勞動(dòng)，選擇理性和有效的育種手段需要進(jìn)行反復(fù)的試驗(yàn)。本報(bào)道尤其是西羅莫司產(chǎn)生菌對(duì)某些抗生素的敏感性、對(duì)自身代謝產(chǎn)物的耐受性與西羅莫司合成能力的關(guān)系值得進(jìn)一步探討?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 程元榮. 新型強(qiáng)效免疫抑制劑雷帕霉素A. 王浴生. 化療藥理學(xué)與臨床研究新進(jìn)展M. 成都：四川大學(xué)出版社，2002：2202 程元榮，鄭衛(wèi). 新分子靶的mTOR和新抗種瘤靶向藥物雷帕霉素及其衍生物J. 中國處方藥，2006，(12):163 程元榮，林文良，黃