脆性X智力低下基因FMR1中不穩(wěn)定DNA序列的研究(1)

1、    脆性X智力低下基因FMR1中不穩(wěn)定DNA序列的研究*(1)    】 目的 檢測(cè)脆性X染色體綜合征智力低下基因FMR1中（CGG）n拷貝數(shù)的多態(tài)性。方法 采用PCR結(jié)合序列膠銀染法、Southern blot雜交分析法，對(duì)299條表型正常的湖南省人群X染色體FRAXA位點(diǎn)（CGG）n拷貝數(shù)的多態(tài)性及分布頻率進(jìn)行了測(cè)定和驗(yàn)證。結(jié)果 顯示其范圍為2040，高峰為28 ，PCR-序列分析銀染法結(jié)果與Southern blot法結(jié)果完全一致。結(jié)論 檢測(cè)了湖南省人群X染色體FRAXA位點(diǎn)（CGG）n拷貝數(shù)的多態(tài)性；運(yùn)

2、用PCR-序列分析膠銀染法快速、直接、簡(jiǎn)便、實(shí)用，適合脆性X綜合征的大規(guī)模群體篩查。    【關(guān)鍵詞】 脆性X綜合征 FMR1 （CGG）n PCR    The study of the unsteady DNA repeat located in the mentally retardant FMR1 gene of fragile X     【Abstract】 Objective To detect the polymorphism of CGG repeats l

3、ocated in the mentally retardant FMR1 gene of fragile X.Methods To detect and test the polymorphism and frequency of CGG repeats located in the FRAXA region come from 299 chromosome of normal hunan pupulations.Results The normal range of CGG repeats is 20-40，the mean number is 28， the data showed th

4、at the results of PCR-sequence gel silver staining was the same as those of PCR-Southern blot. Conclusion Realize the polymorphism of CGG repeats located in the FRAXA locus;2. The PCR-Sequence gel silver staining was more rapid，immediate， simple and economy ，which suits to the colony screening fragi

5、le X syndrome on a large scale.    【Key words】 fragile X syndrome FMR1 CGG repeats PCR    脆性X綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)raX）是常見的遺傳性智力低下性疾病之一，其發(fā)病率僅次于唐氏綜合征。在人群中男性的發(fā)病率約為1/40001，女性的發(fā)病率為1/25002。其在細(xì)胞學(xué)上主表現(xiàn)為Xq27.3帶處有一細(xì)絲樣的脆性位點(diǎn)（FRAXA）3，在分子水平上表現(xiàn)為FMR1基因5端（CGG）n的異常擴(kuò)增。（CGG）n在正

6、常人群體中呈多態(tài)性，n=6-50，當(dāng)n=50-200時(shí)為前突變，n200時(shí)為全突變，同時(shí)伴隨其周圍CpG島異常甲基化4。我們根據(jù)FraX基因致病特點(diǎn)，通過測(cè)定湖南省人群中CGG重復(fù)序列，了解其分布的多態(tài)性，并建立一個(gè)簡(jiǎn)便、快捷的基因檢測(cè)方法。    1 材料和方法     研究對(duì)象及標(biāo)本 208名人群為本校附屬醫(yī)院門診自愿受檢者，男117名，女91名，年齡2456歲，平均36.5歲。分別從肘靜脈抽取血12ml，以草酸鉀抗凝，標(biāo)本按碘化鉀法提取DNA。 主試劑 T4多聚核苷酸激酶、PBR322/MSPI、7-deaz

7、a-dGTP等均為NEB公司產(chǎn)品，雜交液、尼龍膜、PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑均購自上海生工，探針PE5.1由美國紐約州立發(fā)育不全基礎(chǔ)研究所Nanbert Zhong博士惠贈(zèng)。     PCR擴(kuò)增 PCR引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)5，在FMR1基因內(nèi)（CGG）n重復(fù)區(qū)域兩側(cè)合成引物。其中上游引物為：5-GGAACAGCGTTGATCACGTGACGTGGTTTC-3，下游引物為：5-GTGGGCTGCGGGCGCTCGAGG -3。反應(yīng)體積為20l，其中包括10×PCR緩沖液，50100ng模板，每種引物5pmol，200mol/LdNTP，其中dGTP中75%為

8、7-deaza-dGTP，10%DMSO，1U Taq DNA聚合酶。反應(yīng)程序?yàn)椋?5預(yù)變性5min，951min，651min，722min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72延伸10min。 PCR產(chǎn)物的序列膠銀染法檢測(cè) 取10l PCR產(chǎn)物加入載樣緩沖液于6%序列膠電泳。電泳畢經(jīng)乙酸固定、AgNO3溶液染色及Na2CO3顯示后觀察結(jié)果。     Southern印跡雜交 取5l PCR產(chǎn)物于6%序列膠電泳，常規(guī)電轉(zhuǎn)膜，用5末端標(biāo)記法以-32P-ATP標(biāo)記探針PE5.1，經(jīng)預(yù)雜交4h，雜交2h，充分洗膜后常規(guī)壓片，-70放射自顯影。  &#

9、160; 2 結(jié)果 湖南省人群中FRAXA位點(diǎn)（CGG）n的多態(tài)性及分布頻率 用PCR方法分析了299條X染色體。經(jīng)序列膠測(cè)定（圖2），Southern印跡雜交法驗(yàn)證（圖3），表明（CGG）n的拷貝數(shù)在2040之間(見表1)，頻率最高的為28（圖1）。     圖1 299條X染色體的(CGG)n多態(tài)性分布圖    表1 湖南省人群中299條X染色體的CGG重復(fù)數(shù)         6%序列膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物 見圖2。

10、0;   圖2 6%序列膠電泳 Southern blot檢測(cè)PCR產(chǎn)物 Southern印跡雜交結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)帶所在位置與圖2完全一致(見圖3)。圖3 Southern印跡雜交    3 討論      湖南省人群中FRAXA位點(diǎn)（CGG）n的多態(tài)性 299條M:PBR 322/MSPI;1，2，3，4，5，6分別表示CGG重復(fù)數(shù)為28，28，31，28，28，29第1，6道為正常女性，第2，3，4，5道為正常男性(下同)。    表

11、型正常的湖南省人群X染色體FRAXA位點(diǎn)（CGG）n測(cè)定結(jié)果顯示，其拷貝數(shù)范圍為2040，高峰為28，占被檢總數(shù)的64.88%。Hofstee6等報(bào)道的(CGG)n峰值為28，Jacobs7等研究發(fā)現(xiàn)有2個(gè)高峰，即：1923和2831。本文結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符，但未見到明顯的終端重復(fù)數(shù)，說明選取樣本有限。 PCR-序列分析膠銀染法的運(yùn)用 目前已有多種篩查及診斷FraX的方法，但不同方法各有其局限性。如細(xì)胞遺傳學(xué)分析雖可以直接觀察染色體脆性位點(diǎn)的病變，但此方法檢出率較低；DNA連鎖分析較細(xì)胞遺傳學(xué)分析增加了可信度，但該技術(shù)需有先證者，致使檢測(cè)受到一定程度的限制；經(jīng)典的Southern blot

12、法雖然準(zhǔn)確性很高，但需用同位素來標(biāo)記，給操作者帶來了一定的危害，并且操作繁雜，費(fèi)用昂貴，耗時(shí)長；常規(guī)的PCR法雖簡(jiǎn)便，但因無法打開CG含量高的DNA模板導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。因此，探索出一個(gè)穩(wěn)定、快速、適合大規(guī)模人群篩查FraX的方法具有重的意義。我們通過用7-deaza-dGTP代替dGTP的改良以降低Tm值， 對(duì)299條X染色體的FRAXA位點(diǎn)（CGG）n進(jìn)行了擴(kuò)增，取得了較好的效果。檢測(cè)結(jié)果顯示湖南省人群的高峰為28，而且PCR序列膠銀染法與PCR-Southern blot法結(jié)果完全一致。因此。該方法對(duì)FRAXA的大量群體篩查具有重的意義。    

13、60;       李斌元，馬 云，何淑雅，鐘 南，孫春莉，閔凌峰關(guān)鍵詞： 脆性X綜合征 【摘】目的檢測(cè)脆性X染色體綜合征智力低下基         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。    【參考文獻(xiàn)】     1

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