2的表達及AP-1、NFKB信號通路

1、2的表達及AP-1、NFKB信號通路中國醫(yī)學科學院ACIlAACADEMIAEMEDICINAESINICAE致密斑細胞COX-2的表達及AP-1,NFKB信號通路劉冬妍,李學旺,李航,李雪梅,葉文玲中國醫(yī)學科學院中國協(xié)和醫(yī)科大學北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科,北京100730通信作者:李學旺電子郵件:leexuewanghotmail.corn?論著?摘要:目的評估低鹽(LS)培養(yǎng)對小鼠致密斑(MMDDI)細胞環(huán)氧化酶一2(cOx-2)表達及核因子-KB(NF.KB)和活化蛋白.1(AP_1)活性的影響.方法經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染含NF-KB或AP-I的報告質(zhì)粒,采用瞬時表達方法檢測正常鹽(NS)與LS培養(yǎng)對NF

2、.KB和AP-l轉(zhuǎn)錄活性的影響.采用RT-PCR檢測MMDDI細胞C0x-2表達的變化,Westernblot方法檢測細胞內(nèi)p.p38MAPK,p-p44/42,c-Jun,c.Fos和C0x-2蛋白的表達.結(jié)果LS培養(yǎng)促進了MMDDI細胞c0x-2mRNA和蛋白表達(P<0.01).LS培養(yǎng)后,p38和p44/42的磷酸化程度顯著上調(diào)(P<0.01),180rain后達到高峰.p38抑制劑SB-203580,p44/42抑制劑PD-98059可降低LS誘導的C0x-2表達(P<0.01).LS培養(yǎng)促進了c.Jan,c.Fos蛋白表達(P&lt

3、;0.叭),激活了AP?l和NF-KB的轉(zhuǎn)錄活性(P<0.叭).25moVLNF-KB抑制劑PDTC和20p,mol/LAP.1抑制劑curcumin下調(diào)了LS誘導的NF-KB,AP-I活性(P<0.叭).25p,mol/LPDTC,20p,mol/Lcurcumin降低了LS誘導的c0x-2mRNA和蛋白表達(P<0.01).結(jié)論LS培養(yǎng)可促進MMDDI細胞c0x-2的表達,其作用可能與促進p38MAPK,p44/42激酶的磷酸化,增加NF.KB和AP_l的活性有關(guān).關(guān)鍵詞:環(huán)氧化酶一2;核因子-KB;活化蛋白.1;質(zhì)粒;絲裂素激活蛋白激酶中圍分類號

4、:R334.1文獻標識碼:A文章編號:1000-503X(2007)01-0078-05ExpressionofCyciooxygenaseinaMouseMaculaDensaCellLinesandSignalTransductionofNF?-KBandAP?-1LIUDongyan,LIXuewang,LIHang,LIXuemei,YEWenglingDepartmentofNephrology,PUMCHospital,CAMSandPUMC,Beijing100730,ChinaCorrespondingauthor:UXuewangEmail:leexuewanghotmail

5、.cornABSTRACT:ObjectiveToelvaluatetheeffectoflowsalt(LS)ontheexpressionofcyclooxygenase-2(COX-2)andtheactivityofnuclearfactorkappaB(NFKs)andactivatorprotein一1(AP一1)inthemousemaculadensaderived(MMDDI)cellline.MethodsMMDDIcellsweretransfectedwithluciferasereporterplasmidcontainingAP一1orNFKB.Luciferase

6、reporterassaywasusedtoevaluetheeffectofnormalsalt(NS)andlOWsalt(LS)ontheactivitiesofNF.KBandAP.1.ThechangesofCOX-2expressionwereexam.inedbyRTPCR.Theexpressionofp-p38MAPK,p-p44/42,cJun,cFos,andCOX-2inMMDDIcellswereanalyzedbyWesternblot.ResultsTheexpressionsofCOX一2mRNAandproteininMMDD1cellsweresignifi

7、cantlyincreasedbyLS(P<0.O1).Phosphorylatedp38andp44/42MAPkinaseweresignificantlyincreasedbytreatmentat180min(P<0.01).TheupregulatedCOX-2proteinexpressionwithLSweresignificantlyreducedwithSB203580(p38inhibitiors)andPD-98059(p44/42inhibitiors)(P<0.01).Theexpressionsofc-JunandCoFos

8、wereincreasedbyLS.TheluciferaseactivitiesofAP.1andNF.KBwerestimulated基金項目:國家自然科學基金(30370654)SupportedbytheNationalNaturalSciencesFoundationofChina(30370654)78February.2007致密斑細胞COX-2的表達及AP-1,NFKB信號通路inLS(P<0.01),theup-regulatedluciferaseactivitieswattenuatedbyPDrCat25mol/L(NF-KBin-hibitor)andc

9、ureuminat20mol/L(AP.1inhibitor)(P<0.01).alteredCOX-2mRNAabundanceandprotei.nexpressionweredecreasedintreatmentwithPDTCat25tLmol/L,cureuminat20tLmol/L(P<0.01).ConclusionLScaninducetheexpressionofCOX-2inMMDD1cells,whichmaybeinvolvedintheactiva-tionofp38MAPkinase,044/42kinase,AP-1,andNF-K

10、Bpathways.Keywords:cyclooxygenase-2;nuclearfactorkappaB;activatorprotein-l;plasmid;mitogen?activatedproteinkinaseActaAcadMedSin.2007.29(1):7882致密斑(maculadensa,MD)細胞毗鄰于具有分泌腎素功能的球旁器細胞和球外系膜細胞,在腎臟調(diào)節(jié)水鹽代謝過程中發(fā)揮重要作用.在各種高腎素動物模型中,如給動物低鹽飲食,血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensionconvertingenzymeinhibitor,ACEI),袢利尿劑及實驗性腎血管性高血壓

11、模型,MD細胞/近皮質(zhì)的髓袢升枝粗段(corticalthickas.cendinglimb,cTALH)細胞環(huán)氧化酶-2(cyclooxyge-nase-2,COX-2)mRNA和蛋白水平都顯著增加.研究顯示,絲裂素激活蛋白激酶(mitogen.activatedproteinkinase,MAPK)和核因子-KB(nuclearfactorkappaB,NF-KB)可介導脫水誘導的腎臟髓質(zhì)細胞COX-2表達J.本研究探討小鼠致密斑細胞株(maculadensa,MMDD1)細胞COX-2表達的可能細胞分子機制.材料和方法細胞株及主要試劑MMDD1細胞由美國尤他州立大學YangTianxin

12、g教授惠贈,DMEM/F12,胎牛血清購自美國GIBCO公司,抗COX-2抗體購自美國Cayman公司,抗磷酸化p38,抗磷酸化Erk,抗C.Fos,抗c-Jun和抗Actin抗體購自美國SantaCruz公司.正常鹽培養(yǎng)液為DMEM/F12和等滲鹽水按1:1混合;低鹽培養(yǎng)液為DMEM/F12和0.3mol/L甘露醇按1:1配制.SB-203580(p38抑制劑)PD-98059(044/42抑制劑)購自美國Sigma公司.Opti.MENI培養(yǎng)液購自美國GIBCO公司,Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司.質(zhì)粒pAP1.Luc載體,pNFKB-Luc載體和pRL

13、-SV40載體由中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所生化教研室王愛冰,李紅良博士饋贈.質(zhì)粒的擴增和鑒定按常規(guī)方法將宿主菌制成感受態(tài)狀態(tài)的細胞懸液,在100l感受態(tài)細胞中加入10l連接反應液,先后經(jīng)冰浴,熱休克等處理后,涂布于預先涂有氨芐青霉素的LB平板上,37培養(yǎng)1012h,挑選單菌落,于培養(yǎng)基中37cI=振蕩過夜,離心后棄上清,依次加入細胞懸浮液和細胞裂解液,按試劑盒說明收獲質(zhì)粒.取適量CsCI抽提后DNA產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳分析,并測序.細胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染按照試劑盒說明,將含有報告質(zhì)粒(AP-1質(zhì)?；騈F-KB質(zhì)粒)和內(nèi)對照質(zhì)粒的無血清與適量轉(zhuǎn)染試劑混勻.室溫靜置15min后,轉(zhuǎn)移至生長MMD

14、D1的培養(yǎng)基中,并設(shè)3孔未經(jīng)轉(zhuǎn)染的MMDD1作為酶活性的基礎(chǔ)對照.37oC,CO,孵箱內(nèi)孵育6h.棄去培養(yǎng)基,換用正常鹽(normalsalt,NS),低鹽(1owsalt,LS)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)16h.棄去培養(yǎng)基,用PBS沖洗2次,加入100l裂解緩沖液(passivelysisbuffer,PLB)裂解細胞,測定相對熒光素酶活性.RT-PCR將細胞分為NS,LS,LS+SB-203580(10mol/L),LS+SB-203580(20mol/L),LS+PD-98059(10mol/L),LS+PD-98059(20mol/L),Ls+curcumin(AP.1特異性抑制劑)(20mol/

15、L)和LS+PDTC(NF-KB特異性抑制劑)(25Imol/L)共8組,16h后采用Trizol法抽提細胞總RNA.COX-2引物序列:上游5'.ACACTCTATCACTGGCAT.CC-3'下游5'.GAAGGGACACCCTTTCACAT-3tOGAP.DH引物序列:上游5'-AAGGGTGGAGCCAAACGG-3t:下游5'-GGGGGTAGGAAcAcGGAA.3'.擴增條件:95cI=預變性5min,94cI=變性60S,54cI=退火60S,72cI=延伸60S,30個循環(huán)后72cI=延伸10min.擴增產(chǎn)物在1.8%瓊脂糖凝膠

16、電泳中分離,凝膠成像系統(tǒng)拍照分析,計算特異擴增條帶的總吸光度值,并以相應的GAPDH值進行校正.WesternblotLS培養(yǎng)30,60,180min和NS培養(yǎng)I80min后提取總蛋白檢測p38,pErk.NS,LS培養(yǎng)16h后提取細胞總蛋白檢測c.Fos,c-Jun.28h后提取細胞總蛋白檢測COX-2.收集細胞總蛋Vo1.29No.179r扣圍醫(yī)學科學碗白.加入含有蛋白酶抑制劑(100g/mlPMSF.10us/mlAprotinin10t,eVndLeupeptin.20mIPepsatin)的蛋白裂解液(0.OItoo/JPBS,1%P一40.1mmol/LEDTA,0.5%脫氧眥酸鈉

17、,0.1%SDS)裂解細胞冰浴中超聲破碎細胞.10s1次,共56次=冰浴30rr|irl,I2000g4離心l5rain,收集上清蛋白檢測試劑盒定量.按測定的蛋白濃度,取適量待測樣品與上樣緩沖液(1o0mmol/kTris,clpH68,4%SDS,20%甘油,0.2%渙酚蘭.200mmol/LDTF)以1:I混合,100加熱5rain.取301OOg蛋白按常規(guī)方法進行SDS.PAGE電泳COX一2的分離膠濃度為8%.cFos,cJun的分離膠濃度是10%,p38,perk分離膠為I2%一統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)±表示,采用SPSS11.5軟件進行單因素方差分析廳差具有齊性時用S-NK檢驗

18、.方差不齊用TaJnhanesT,檢驗進行各組問比較.所有數(shù)據(jù)均重復3次,P<005表示差異有娃著性結(jié)果質(zhì)粒的鑒定pAP1一kucvector,pNFKBIuvector是環(huán)形質(zhì)粒,全長均為5000bp.經(jīng)電泳后得到的條帶在65579416bp(圖1)一l23圖1質(zhì)粒DNA凝脞電淋圈Fig】Electrophoresisofdamidinagarosegel1ON&銻度;2.Pt熒光質(zhì)羋芷3.NFKB質(zhì)特IDNAladder;2pAPILtrvfor;3pNFKBIu-vP【f各組磷酸化p38MAPK和p44/42激酶的表達Ls培養(yǎng)屐著增加MMI)D1細胞p38M

19、APK和p44/42的磷酸化程度【2),L5180rain組磷陵化程度比較明顯,分別為LS0min組的1.65倍和6.4倍(1<0.0j),各組總p38和F,44/42無明艘改變.柵Feoruaw2007脅Ph,pho-p384,-o38000Z皇勇|iiPhpho-2:=:=:r"q_38Oo042ON344OtX)42(m044(mc低鹽培養(yǎng)()刪3On1I60l80刪Lowsaltmedium圖2MMDI)I細胞磷蔽化p38,#4/042的表選Fig2ExpressionsofvF,38日nJpr,44/t2inMMDDIcell*Mr:豐阿對分子質(zhì)量1wrrel

20、ativemolecularmass各組NF-KB和AP-1轉(zhuǎn)錄活性的變化LS培養(yǎng)明顯澈活MMI)DI細胞內(nèi)NFKB和AP一1的轉(zhuǎn)錄活性,分別上調(diào)了2194%和125.9%(P<0.01)25p,moVLNFKB抑制剎PD_rC將Ls秀導的NFKB轉(zhuǎn)錄活下嗣了66.3啦.20moV1.AP一1抑制利ureumin將LS誘導的AP.1轉(zhuǎn)錄活性降低了49.3%各組MMDD1細胞g-Jun和c-Fos蛋白表達Ls培養(yǎng)促進MMDD1細胞(-一Jun,cFos蛋表達,分別是NS組的127倍和124倍(P<0.0I)【圖3).(-jL"r39()00確睜-62tyro

21、圖3MMDDI細胞c-.1ur,一s孟白表達Fig3ExpressionsofI/-Junand?FasinMMDDIcellsI丑=常鹽培薦;2骶缸培養(yǎng)Ittf)lFfl3al日Itmedium:2lowsaltmedium各組MMDDi細胞COX?2mRNA表達Ls培養(yǎng)促進COXmIA表逃較s組升高了26l5%(P<0OI).10llmo/L20p.nmL/Lp38抑制劑SB一203580和20l1l0J/L44/42抑制削PD-98059明顯抑制了Ls誘導的MMDI)l細胞COX.2mRNA,使其下凋241%,37.9%(P<0.01c圈4):25nloL,I

22、_PD'I'C干lJ2Orno/trtlretlrtlilI抑制Ls誘導的MMDDI細胞COX-2n,ItNA表達,使分別下降J52.O%和48.J%(P<O.01)【5)致密斑細胞COX.2的表達及AP?】,NFKB情號通路m.E=z=二Z;嗣圖4COX.2mRNA表站FiR4ExpressionofCOX,2eaRNAI正常鹽;2低釷;3.低鹽+10u.mol/LSB一203580:4慨鹽一20la+moHSB一203580:5低鹽+10p.mol,"1PD一98059;6坻枯一2t¨m01LPI)一980591NS:2:3.I+l0ixm

23、oL/ISB一203580;41S0lxrnob"l,SB一203580:5+10nLPD9805q:6+2Bull,【_P1)一98059圖5PDTC和umn對COX一2mRNA表達的影響5EffecLofPDTCanti(pLIIX+tlmilrIorlthePpressonofCOX-2mRNAl正常鹽2低鹽;3.低鹽十25IxmoL/LPDTC;4低鹽+20+mnPLeoroumJn1.NS;2LS;3LS+25/.mo/lPDPC;4.LS一2aptmoJ/Lt'+tteumin各組MMDDI細胞COX?2蛋白表達Ls促進COX-2蛋白表達,較NS組升高了I36.O

24、%tP(0.01)=l0和2O1.mol/【.SB一203580及l(fā)0和20n1ol/LPD-98059明顯抑制Ls誘導的MMDDI細胞COX一2蛋表達+分別降低了4I4%,673嚼-,379%和48.3%(P<0.01)(圖6).25mol/LPDTC和2Omol/lcurcmrain抑制低鹽誘導的COX一2蛋白表達(P<00I),下降了54O%和46.O%(圈7)cox一2-_-._-720(X】43000圖6COX一2蛋白表達Flg6ExpressionofCOX-2pmtein1低鹽+10p.mnl/ISB?203580;2佩鹽+20m01./LSB一203

25、580I3低鹽+J0p.moLqP1).98059;4低鹽+20v,mtd/LP0-98059;5正常鹽;6低鹽ll+10ttn;ol/LSB?20358012.LS+20v+moL."LSB-203580;3I+】0n0LPD-984)59;4:I一20moL/L1'1)-98059;5NS;6.LS1234MrCOX一2q嘲_囊嘲_I7200043000匿7PDTC和curcumin對COX一2蛋白表達的影響Fig7Effeck,ofPDTCandcureuminontheexpressionofCOX一2prolein1.正常鹽:2低鹽3低鹽+25p.moVLPDTC;

26、4低鹽十20l+tmoL.'Lcurcu1lJ1lNS;2LS:3.LS十25v,moL/LP州:4LS+20moVLctliXUll|itq,討論MD細胞毗鄰于具有分泌腎素功能的球旁器細胞和球外系膜細胞,在腎臟調(diào)節(jié)水鹽代謝過程中有重要作用在各種高腎素動物模型葉l,MD細胞COX-2表達增加,目前有關(guān)MD細胞內(nèi)COX-2的表達調(diào)控機制還不是很清楚COX-2基因表達受多個程序間控.Cheng等在Ls飲食的動物腎臟皮質(zhì)MD和cTALH細胞處檢測到高表達的磷酸化p38.這提示Ls誘導的COX一2表達及PGE,釋放可能由p3gMAPK途徑調(diào)控本研究進一步證實,Ls培養(yǎng)可誘導MMDDI細胞內(nèi)1:

27、38MAPK和p44/42快速磷酸化,并于l8【】rain時達到高峰,磷酸化時間明顯早于COX-2mRNA和蛋白的高峰時間.5i,p38MAPK和p44/42通路選擇性阻斷劑sB一203580和PD-98059能顯著下凋Ls誘導的COX-2mRNA和蛋白表述及PGE,的釋放,提示Ls誘導的COX-2表達i1111可能是通過激活p38MAPK和p44/42激酶的活性實現(xiàn)的除轉(zhuǎn)采水平外,Cheng等研究還發(fā)現(xiàn)Ls培養(yǎng)可促進兔IJj細胞COX一2表達,加用MAPK阻斷劑后COX-2rnRNA的半衰期顯著降低,表明MAPK劉于轉(zhuǎn)錄后水平確保COX一2mRNA的穩(wěn)定性電是至關(guān)重要的有關(guān)髓質(zhì)問質(zhì)細胞的研究

28、顯示,高滲條件下有更多的P65和P50結(jié)合于人COX-2啟動于的NFKB位點上.經(jīng)NF-KB的硅性基負性抑制劑(IKBntut)轉(zhuǎn)導后,由高滲誘導的COX-2mRNA和蛋白表達受到明屁抑制.提示脫水通過恬化NFKB途徑,濟導髓質(zhì)問質(zhì)細胞表達C(1X-2本研究發(fā)現(xiàn)MMDD細胞瞬時轉(zhuǎn)染FKB熒光質(zhì)粒后,培養(yǎng)可明顯上蒯NFKB的轉(zhuǎn)錄活勝,加用NFKB活性抑制劑pDrlCvol29NoTSl中國醫(yī)學科學院后COXmRNA和蛋白表達都降低,進一步證實LS可能通過上調(diào)NF.KB轉(zhuǎn)錄活性,增加COx-2表達.AP.1是炎癥,腫瘤情況下,調(diào)節(jié)COx-2表達的重要轉(zhuǎn)錄因子,研究發(fā)現(xiàn)非甾體類抗炎藥可抑制p38MA

29、PK的磷酸化,抑制c-Fos和c4un二聚體復合物與AP.1DNA位點的結(jié)合,下調(diào)AP-1的活性,從而降低COx-2表達J.本研究發(fā)現(xiàn)瞬時轉(zhuǎn)染AP-1質(zhì)粒后,LS培養(yǎng)促使細胞內(nèi)c4un和c-Fos蛋白表達,增加AP-1的轉(zhuǎn)錄活性.Curcumin抑制c-Fos和c4un二聚體復合物的形成,從而抑制LS誘導的AP-1轉(zhuǎn)錄活性,降低LS誘導增加的COX-2表達.這說明LS培養(yǎng)很可能通過某些途徑激活c.Jun和c.Fos蛋白,促使二聚體結(jié)合到C-2基因AP.1位點上,促進C0-2基因轉(zhuǎn)錄.Woo等卻發(fā)現(xiàn)巨噬細胞內(nèi)p38MAPK對COX-2表達有正向調(diào)節(jié)作用,而c-Jun(JNK通路)對其有負向調(diào)節(jié)作用.綜上所述,LS可誘導MMDD1細胞COX-2表達增加,其作用機制可能是多途徑的.本研究結(jié)果初步表明,MMDD1細胞內(nèi)COx-2的表達與p38MAPK,p44/p42激酶的磷酸化,AP-1和NF-kB轉(zhuǎn)錄活性的增加密切相關(guān).參考文獻1CastropH,KlarJ,WaerC.Generalinhibitionofrenocor.ticalcyclooxygenase-2expressionbytherenin?angiotensins2February.2007systemJ.AmJPhysiolRenalPhysiol,2003,284(4):F5l8.F524.2Y