BJS201703豆芽中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的測(cè)定

1、附件 3豆芽中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的測(cè)定BJS 2017031 范圍本方法規(guī)定了豆芽中 11種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。本方法適用于豆芽中 6- 芐基腺嘌呤、 4- 氯苯氧 乙酸、赤霉素、吲哚乙酸、吲哚丁 酸、 2,4-二氯苯氧乙酸、 4- 氟苯氧乙酸、異戊烯腺嘌呤、氯吡脲、多效唑和噻苯隆的檢測(cè)。2 原理試樣經(jīng)含 1%甲酸的乙腈溶液勻漿提取，脫水，離心后，上清液經(jīng)分散固相萃取凈化，用 高效液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，外標(biāo)法定量。3 試劑和材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水。3.1 試劑3.1.1 甲醇：色譜純。3.1.2 乙腈：色譜

2、純。3.1.3 甲酸：色譜純。3.1.4 乙酸銨：色譜純。3.1.5 無(wú)水硫酸鎂。3.1.6 無(wú)水乙酸鈉。3.1.7十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）:粒徑范圍為40 ym60 “3.2 試劑配制3.2.1 含 1%甲酸的乙腈溶液:量取10 mL 甲酸，加乙腈稀釋至 1000 mL ，混勻。3.2.2 含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液：稱取0.3854 g乙酸銨，用水溶解并稀釋至1000 mL , 加入 1 mL 甲酸，混勻。3.3 標(biāo)準(zhǔn)品6- 芐基腺嘌呤、 4-氯苯氧乙酸、赤霉素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、2,4-二氯苯氧乙酸、 4-> 90%。標(biāo)準(zhǔn)品的中A 中的表 A.1 。氟苯氧

3、乙酸、異戊烯腺嘌呤、氯吡脲、多效唑、噻苯隆標(biāo)準(zhǔn)品，純度均 文名稱、英文名稱、 CAS 登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量詳見(jiàn)附錄3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制3.4.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（ 1 mg/mL ）：精密稱取 6-芐基腺嘌呤、 4-氯苯氧乙酸、赤 霉素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、2,4-二氯苯氧乙酸、 4-氟苯氧乙酸、異戊烯腺嘌呤、氯吡脲、多效唑、噻苯隆標(biāo)準(zhǔn)品（3.3）各10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度， 搖勻，制成濃度各為 1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液，-20C保存。342混合標(biāo)準(zhǔn)中間液 A （ 10卩m/L ）:分別精密量取11種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1mg/m

4、L ）（3.4.1 ）各1 mL,置于同一 100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度均為10卩g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液 A。3.4.3 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液 B （1卩g/m）L :精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液 A （10卩g/m） （3.4.2） 1 mL , 置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度均為1卩g/m啲混合標(biāo)準(zhǔn)中間液 B。3.4.4空白基質(zhì)提取液：稱取空白試樣各 10.0 g （精確至0.01 g）,分別置于50 mL具塞離心 管中,自 “加入 20 mL 含 1%甲酸的乙腈溶液 ”起與樣品同法處理（ 6.1 和 6.2）,作為空白基質(zhì) 提取液。3.4.5基質(zhì)

5、混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液B （1卩g/mL （ 3.4.3） 0 L10卩、20卩和40卩,及混合標(biāo)準(zhǔn)中間液 A （ 10卩g/m） （ 3.4.2） 10卩、15卩和20卩, 用空白基質(zhì)提取液（3.4.4）定容至1.0 mL,作為基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 S0、S1 S6。濃度依 次為 0 ng/mL 、 10 ng/mL 、 20 ng/mL 、 40 ng/mL 、 100 ng/mL 、 150 ng/mL 和 200 ng/mL ,或依 需要配制適當(dāng)濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。臨用新制。4 儀器和設(shè)備4.1高效液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源（ESI 源）。4

6、.2渦旋混合器。4.3離心機(jī)：轉(zhuǎn)速 > 10000 r/min。4.4電子天平：感量分別為0.01 mg 和 0.01 g。4.5氮吹濃縮儀。4.6高速勻漿機(jī)。4.7具塞離心管： 50 mL和 15 mL。4.8QuEChERS 離心管：內(nèi)含 300 mg 無(wú)水硫酸鎂和100 mg C18 。4.9微孔濾膜：孔徑為0.22 m有機(jī)相型微孔濾膜。235試樣制備與保存將豆芽切碎后用組織粉碎機(jī)充分粉碎混勻，均分成兩份，作為試樣和留樣，分別裝入潔凈容器中，密封并標(biāo)記，于F -18C保存。6測(cè)定步驟6.1提取準(zhǔn)確稱取10.0 g （精確至0.01 g）試樣置于 50 mL具塞離心管（4.7）中，加

7、入20 mL含 1%甲酸的乙腈溶液（3.2.1），高速勻漿 2 min，加入4 g無(wú)水硫酸鎂（3.1.5）和1 g無(wú)水乙 酸鈉（3.1.6），立即渦旋混合 1 min，以10000 r/min離心5 min使乙腈和水相分層。6.2 凈化精密量取上層乙腈溶液 4 mL置于 QuEChERS離心管（含 300 mg無(wú)水硫酸鎂和 100 mg C18） （4.8）中，渦旋混合 2 min，以14000 r/min離心5 min，移取全部上清液于 15 mL 離心管（4.7）中，于45 C水浴中氮吹至近干，用甲醇定容至 1 mL,渦旋混勻1 min，以14000 r/min離心5 min，上清液經(jīng) 0

8、.22 m有機(jī)相濾膜（4.9）過(guò)濾后，取續(xù)濾液供高效液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。6.3色譜測(cè)定6.3.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)6.3.1.1液相色譜條件a）色譜柱：C18柱，100 mmx 3.0 mm，粒徑 2.7 m,或性能相當(dāng)者。b）流動(dòng)相：A為含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液（3.2.2）, B為甲醇。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。c）流速：300 卩 L/mind）柱溫：35 C。e）進(jìn)樣量：5卩。表1梯度洗脫程序時(shí)間(min)流動(dòng)相A（%）流動(dòng)相B（%）Initial9553.009553.10901019.00208021.00208021.1095524.009556.3.1.

9、2質(zhì)譜條件a）離子源：電噴霧離子源（ESI源）。b）檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM ）。C）掃描方式：6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、赤霉素、2,4-二氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸、異戊烯腺嘌呤、氯吡脲、噻苯隆采用負(fù)離子模式掃描；吲哚乙酸、吲哚丁酸、多效唑采用 正離子模式掃描。d）霧化氣（GS1）、氣簾氣（CUR ）、輔助氣（GS2）、碰撞氣（CAD ）均為高純氮?dú)饣蚱渌线m氣體，使用前應(yīng)調(diào)節(jié)相應(yīng)參數(shù)使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測(cè)要求，參考條件詳見(jiàn)附錄B。e）電噴霧電壓（IS）、碰撞電壓（CE）、去簇電壓（DP）、碰撞室入口電壓（EP）、碰撞室出口電壓（CXP）等參數(shù)使用前應(yīng)優(yōu)化至最佳靈敏度，監(jiān)測(cè)離子對(duì)和定

10、量離子對(duì)等信息詳見(jiàn)附錄B中的表B.1和B.2。6.3.2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制作將基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（3.4.5）按儀器參考條件（6.3.1 ）進(jìn)行測(cè)定。以基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn) 工作溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。6.3.3 定性測(cè)定在相同試驗(yàn)條件下測(cè)定試樣和基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，記錄試樣和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中植物 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的色譜保留時(shí)間，以相對(duì)于最強(qiáng)離子豐度的百分比作為定性離子的相對(duì)離子豐度。若試樣中檢出與基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.4.5）中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑保留時(shí)間一致的色譜峰，且其定性離子與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)的定性離子的相對(duì)豐度相比，偏差不超過(guò)表2規(guī)定的范圍，則可以確定試樣中檢出相應(yīng)植

11、物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。表2定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度（%）>50>20 50>1020<1025允許的相對(duì)偏差（%）+20+25+30+50634 定量測(cè)定若試樣檢出與基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液一致的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線按外標(biāo) 法以峰面積計(jì)算得到其含量?？瞻讟悠芳訕?biāo)試樣參考色譜圖見(jiàn)附錄C中的圖C.1。6.4 空白試驗(yàn)除不加試樣外，均按試樣同法操作。7結(jié)果計(jì)算結(jié)果按式（1）計(jì)算: 1）-（式中：X 試樣中各待測(cè)組分的含量，單位為微克每千克（ 卩g/kg ;c 從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中讀出的供試品溶液中各待測(cè)組分的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V試樣溶液

12、最終定容體積，單位為毫升（ mL）;f試樣制備過(guò)程中的稀釋倍數(shù)，本方法中為5;m 稱樣量，單位為克（g ）。計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有 效數(shù)字。8檢測(cè)方法的靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度8.1靈敏度本方法中6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、赤霉素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、2,4-二氯苯氧乙酸、4-氟苯氧乙酸、異戊烯腺嘌呤、氯吡脲、多效唑、噻苯隆檢出限均為5/kg ;定量限均為 10 ©/kg。8.2 準(zhǔn)確度本方法在10100 ©/kg添加濃度范圍內(nèi)，回收率為60% 120%。20%。8.3精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差

13、值不得超過(guò)算術(shù)平均值的 27AA附錄A11種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的化合物相關(guān)信息表A.111種化合物的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量序號(hào)中文名稱英文名稱CAS登錄號(hào)分子式相對(duì)分子質(zhì)量1赤霉素Gibberellic acid77-06-5C19H22O6346.3726-芐基腺嘌呤6-Be nzylami no puri ne1214-39-7C12H11N5225.253吲哚乙酸In dole-3-acetic acid87-51-4C10H9NO2175.184噻苯隆Thidiazuro n51707-55-2C9H8N4OS220.2552,4-二氯苯氧乙酸2,4-Dic

14、hlorophe no xyaceticacid94-75-7C8H6CI2O3221.0464-氯苯氧乙酸4-Chlorophe no xyacetic acid122-88-3C8H 7CIO 3186.597氯吡脲Forchlorfe nuron68157-60-8C12H10CIN3O247.688多效唑Paclobutrazol76738-62-0C15H20CIN 3O293.799吲哚丁酸3-I ndolebutyric acid133-32-4C12H13NO2203.24104-氟苯氧乙酸4-Fluorophe no xyacetic acid405-79-8C8H 7FO3

15、170.1411異戊烯腺嘌呤N6-(delta2-Isope nten yl)-ade nine2365-40-4C10H13N 5203.24 29BB附錄B參考質(zhì)譜條件1）負(fù)離子模式掃描質(zhì)譜條件a）離子源：電噴霧離子源（ESI源）;b）檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；c）電噴霧電壓（IS）: -5500 V（ ESI-）；d）氣簾氣（CUR）: 20 L/min ；e）霧化器（GS1）： 45 L/min ；f）輔助氣壓力（GS2）: 35 L/min ;g）離子源溫度（TEM ）: 500 C。表B.1負(fù)離子模式下 8種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑定性、定量離子對(duì)和質(zhì)譜分析參數(shù)序 號(hào)分析物離子對(duì)m/z

16、去簇電壓V碰撞能量eV入口電壓V出口電壓V16-芐基腺嘌 呤224.2/133.0*-77-31-4-6224.2/106.0-80-46-9-18224.2/117.0-76-47-9-182赤霉素344.9/142.5 *-79-33-10-12344.9/238.9-78-22-8-14344.9/220.6-70-35-10-1432,4-一氯苯氧 乙酸218.9/161.0 *-18-16-9-26218.9/125.1-34-37-6-5218.9/89.1-21-49-12-1044-氯苯氧乙 酸184.8/126.7 *-43-22-6-9184.8/110.7-39-22-6

17、-95噻苯隆218.9/99.9 *-50-16-15-15218.9/70.7-51-45-15-10218.9/91.9-46-49-13-136氯吡脲245.9/126.6 *-40-11-3-14245.9/90.9-40-37-3-147異戊烯腺嘌 呤202.0/133.9 *-58-23-10-10202.0/106.8-58-36-10-10202.0/157.9-70-31-10-1084-氟苯氧乙 酸169.2/110.9 *-53-16-10-22169.2/94.9-46-22-8-17*定量離子對(duì)。2）正離子模式掃描質(zhì)譜條件a）離子源：電噴霧離子源（ESI源）;b）檢測(cè)

18、方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM ）;c）電噴霧電壓（IS）: 5500 V（ ESI+）；d）氣簾氣（CUR）: 20 L/min ；e）霧化器（GS1）： 45 L/min ；f）輔助氣壓力（GS2）: 35 L/min ;g）離子源溫度（TEM ）: 500 C。表B.2 正離子模式下 3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑定性、定量離子對(duì)和質(zhì)譜分析參數(shù)序號(hào)分析物離子對(duì)m/z去簇電壓V碰撞能量eV入口電壓V出口電壓V1多效唑294.2/70.1 *38521213294.2/125.052521282吲哚乙酸176.2/130.3 *6020108176.2/103.278461083吲哚丁酸204.1/186.2 *5315915204.1/130.45830710204.1/144.27630715* 、 定量離子對(duì)。注：附錄B所列參考質(zhì)譜條件僅供參考，當(dāng)采用不同質(zhì)譜儀器時(shí)，儀器參數(shù)可能存在差異，測(cè)定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。31cc附錄C11種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑特征離子的提