實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)綜述

1、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)綜述一基本原理 1.PCR反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 右圖為PCR反應(yīng)曲線（橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)表征產(chǎn)物量），不同的曲線代表初始模板量不同的 PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)公式為： Cn=C0(1+E)n 其中C0和Cn分別為初始模板和n循環(huán)的拷貝數(shù)，n為循環(huán)數(shù)，E為擴(kuò)增效率（0E1），理想狀態(tài)下（即每個(gè)循環(huán)中所有模板均與引物結(jié)合并等到擴(kuò)增），E為1。 由上圖可知，只有在線性區(qū)段E值才為定值，這樣才能通過(guò)檢測(cè)Cn定量C0，由于終點(diǎn)檢測(cè)不能保證在線性區(qū)段，所以重復(fù)性不好，實(shí)時(shí)檢測(cè)（每個(gè)循環(huán)檢測(cè)一次）技術(shù)解決了這個(gè)問(wèn)題。 2.定量PCR原理 定量PCR是將待測(cè)標(biāo)本與一系列濃度（C0）

2、已知的標(biāo)準(zhǔn)品在同一條件下共同擴(kuò)增，并進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)值及已知的C0值作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如右圖（橫作標(biāo)為的C0對(duì)數(shù)值），再根據(jù)待測(cè)標(biāo)本的檢測(cè)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到待測(cè)標(biāo)本的C0值。 3.信號(hào)產(chǎn)生 目前定量PCR技術(shù)信號(hào)產(chǎn)生都是基于FRET (fluorescence resonance energy transfer)的原理，即在一定波長(zhǎng)的光激發(fā)下，一個(gè)熒光基團(tuán)A發(fā)光，并且被鄰近的另一個(gè)熒光基團(tuán)B吸收，使熒光基團(tuán)B發(fā)光。如檢測(cè)熒光基團(tuán)A，應(yīng)在FRET消除后；如檢測(cè)B，則應(yīng)在FRET發(fā)生時(shí)檢測(cè)。 根據(jù)信號(hào)產(chǎn)生方式的不同可將定量PCR技術(shù)分為三類：Taq

3、Man Probes技術(shù)；Hybridization Probes技術(shù)；Molecular Beacons技術(shù)。 TaqMan Probes技術(shù)（右圖A）是Perkin Elmer公司1995年研制，利用熱穩(wěn)定DNA聚合酶53外切酶活性，將TaqMan 探針5端熒光基團(tuán)切去，使之與3端熒光基團(tuán)分離、熒光淬滅消失，在特定波長(zhǎng)下檢測(cè)5端熒光基團(tuán)即可表征PCR產(chǎn)物的量。 Hybridization Probes技術(shù)（右圖B）是Roche公司建立的，PCR反應(yīng)退火過(guò)程中，兩個(gè)探針與模板雜交（相鄰一個(gè)堿基），發(fā)生FRET，這時(shí)檢測(cè)第二

4、個(gè)熒光基團(tuán)即可表征PCR產(chǎn)物的量。Hybridization Probes技術(shù)要求熱穩(wěn)定DNA聚合酶不具備53外切酶活性，而是在引物延伸過(guò)程中被取代，使探針可在下一循環(huán)再與模板雜交，如探針被降解，可導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。 Molecular Beacons技術(shù)（上圖C）利用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針，當(dāng)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，發(fā)生熒光淬滅，退火過(guò)程中，探針與模板雜交，熒光淬滅消失，在特定波長(zhǎng)下檢測(cè)5端熒光基團(tuán)即可表征PCR產(chǎn)物的量。二.熒光標(biāo)記1.TaqMan ProbesTaqMan探針通常在5端以熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記，靠近3端以熒光基團(tuán)TAMRA標(biāo)記，3端磷酸化以防止探針在PCR擴(kuò)增過(guò)程中被延伸。下

5、表列出了兩種熒光基團(tuán)的吸收及發(fā)射波長(zhǎng)。 FAM TAMRA 吸收波長(zhǎng) 492 547 發(fā)射波長(zhǎng) 518 573 2.Hybridization ProbesHybridization探針技術(shù)中，上游donor Probe 3端以熒光基團(tuán)Fluorescein標(biāo)記；下游acceptor Probe 5端以Roche的LC-Red 640標(biāo)記（當(dāng)用雙熒光基團(tuán)時(shí)還可同時(shí)使用LC-Red 705），3端磷酸化以防止探針在PCR擴(kuò)增過(guò)程中被延伸。也有文獻(xiàn)報(bào)道acceptor Probe 5端以Cy5標(biāo)記，下表列出了各種熒光基團(tuán)的吸收及發(fā)射波長(zhǎng)。 Fluorescein LC-Red

6、640 LC-Red 705 Cy5 吸收波長(zhǎng) 494 625 685 643 發(fā)射波長(zhǎng) 519 640 705 667 3.熒光標(biāo)記基團(tuán)與PCR儀的激發(fā)與檢測(cè)波長(zhǎng)由于熒光標(biāo)記基團(tuán)的選擇還受到定量PCR儀所提供的激發(fā)和檢測(cè)波長(zhǎng)的制約，所以這里介紹一下臨床應(yīng)用中主流機(jī)型所提供的檢測(cè)波長(zhǎng)，見(jiàn)下表。 GeneAmp 5700SDS ABI Prism7700(適用于科研) LightCycler 檢測(cè)波長(zhǎng) 530nm 500-660nm 530nm;640nm;705nm 三.TaqMan Probes技術(shù)要點(diǎn)TaqMan Probes技術(shù)要求所用的熱穩(wěn)定DNA聚合酶不但要具有53外切酶活

7、性,而且要求所獲得的擴(kuò)增曲線符合PCR反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。Matthew J.Longley等（1990）研究了熱穩(wěn)定DNA聚合酶的53外切酶活性,認(rèn)為：（）其53外切酶活性和DNA聚合酶活性位于同一肽段；（）53外切酶活性依賴于雙鏈DNA（如右圖）；（）53外切酶活性具有熱穩(wěn)定性，之所以70較50活性低（如右圖）是由于高溫破壞了探針與模板間的雙鏈結(jié)構(gòu)。K-A.Kreuzer等（2000）研究了15種熱穩(wěn)定DNA聚合酶（商品）的53外切酶活性，其中7種聲稱具有53外切酶活性，右圖是這種酶的定量PCR反應(yīng)（TaqMan）曲線,其中部分酶沒(méi)有53外切酶活性、部分酶具有較弱的53外切酶活性、只有一種酶的擴(kuò)增

8、曲線（A）符合PCR反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。下表列出了部分文獻(xiàn)報(bào)道的TaqMan Probes技術(shù)所使用的酶和其它相關(guān)參數(shù)。 Target P1 P2 Probe Enzyme 退火溫度 延伸溫度 HCV 19 25 27 AmpliTaq DNA polymerase 60 60 HIV 19 22 32 AmpliTaq Gold polymerase(Perkin-Elmer) 60 60 Albumin 22 22 26 AmpliTaq Gold polymerase(Perkin-Elmer) 65 65 16S rRNA 27 26 28 Taq DNA polymerase 62 62 g

9、B gene 18 18 27 AmpliTaq Gold polymerase (Perkin-Elmer) 58 58 omlA 22 22 21 AmpliTaq Gold polymerase (Perkin-Elmer) 62 62 lytA 21 21 25 Taq DNA polymerase 60 60 四.Hybridization Probes技術(shù)要點(diǎn)Hybridization探針技術(shù)要求所用的熱穩(wěn)定DNA聚合酶沒(méi)有53外切酶活性,以保證探針有恒定的濃度并能反復(fù)與模板雜交。Jochen,Wilhelm等（2001）研究了Taq酶53外切酶活性對(duì)基于Hybridization

10、探針技術(shù)的定量PCR的影響，認(rèn)為：（）Taq酶53外切酶活性降解了部分探針；（）Taq酶的stoffel片段（去除N端289個(gè)氨基酸）不具有53外切酶活性，其在高濃度Mg2+存在下，能獲得較好的PCR動(dòng)力學(xué)曲線（如下圖）；（）stoffel片段因高M(jìn)g2+濃度造成的非特異性擴(kuò)增可采用加入TaqStart antibody的方式消除。五.TaqMan探針與Hybridization探針技術(shù)的比較1. Hybridization探針技術(shù)的特異性高于TaqMan探針，因其信號(hào)的產(chǎn)生依賴于兩個(gè)獨(dú)立探針的特異性。但其在探針設(shè)計(jì)上需要更多的可選序列；2. TaqMan探針技術(shù)的開(kāi)放性優(yōu)于Hybridization探針技術(shù)，原因有二：（）TaqMan探針技術(shù)的熒光標(biāo)記系統(tǒng)是開(kāi)放的，易從第三方獲得，而Hybridization探針的熒光染料為羅氏專有，易受其控制；（）TaqMan探針和Hybridization探針?lè)謩e在ABI Prism7700和羅氏LightCycler上建立，因熒光標(biāo)記和儀器檢測(cè)波長(zhǎng)的不同，限制了其在兩種儀器上的通用性，目前已有文獻(xiàn)報(bào)道將TaqMan探針用在LightCycler上，但未見(jiàn)報(bào)道Hybridization探針用在ABI Prism7700上，可能是AB