痛風(fēng)飲對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠抗炎鎮(zhèn)痛作用機(jī)制的研究

1、痛風(fēng)飲對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠抗炎鎮(zhèn)痛作用機(jī)制的研究 作者：楊洪霞 楊麗蕓 張靈敏 靳紅微【摘要】 目的研究民間驗(yàn)方痛風(fēng)飲1付對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的抗炎鎮(zhèn)痛作用機(jī)制。方法通過(guò)對(duì)痛風(fēng)模型大鼠應(yīng)用痛風(fēng)飲觀(guān)察急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠患肢壓力及步態(tài)積分；踝周徑變化值；檢測(cè)白細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，血清IL-1、IL-6水平；以及右踝關(guān)節(jié)組織HE染色。結(jié)果痛風(fēng)飲能明顯減輕實(shí)驗(yàn)性大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度，以及患肢站立及行走時(shí)壓力積分，能降低白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及IL-1、IL-6水平，具有改善致炎關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生和減輕炎細(xì)胞浸潤(rùn)的作用。結(jié)論痛風(fēng)飲具有抗炎鎮(zhèn)痛作用。 【關(guān)鍵詞】 痛風(fēng)飲 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎 微晶鈉 白細(xì)胞 中

2、性粒細(xì)胞 白細(xì)胞介素-1 白細(xì)胞介素-6急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是痛風(fēng)的首發(fā)癥狀，常夜間發(fā)作，疼痛劇烈。西藥秋水仙堿為治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎首選的一種特效藥物，但有導(dǎo)致骨髓抑制、肝細(xì)胞損害、禿發(fā)、精神抑郁、上行性麻痹、呼吸抑制等副作用1。目前未見(jiàn)有1付中藥治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的報(bào)道，我們采用民間驗(yàn)方1付中藥“痛風(fēng)飲”治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎取得了良好的臨床療效。為進(jìn)一步探究其作用機(jī)理，我們進(jìn)行了痛風(fēng)飲對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的抗炎鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究。 1 材料 1.1 動(dòng)物健康Wistar大鼠48只，全雄，體重（24520）g，清潔級(jí)，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 1.2 藥物痛風(fēng)飲由伸筋草、萆?Z、木瓜、五加

3、皮、粉防己、羌活、獨(dú)活、威靈仙、千年健、追地風(fēng)、川牛膝、川芎、乳香、沒(méi)藥等組成，每毫升藥液含生藥約13.5 g；秋水仙堿溶液配成0.135 mg/ml。 1.3 試劑尿酸（uric acid），德國(guó)Aha Aesar公司；氫氧化鈉（NaOH），北京市盛達(dá)化工技術(shù)有限公司；大鼠白細(xì)胞介素-1（IL-1）放免試劑盒，解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所；大鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）放免試劑盒，北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司。 2 方法 2.1 尿酸鈉結(jié)晶及尿酸鈉溶液的制備取1g尿酸加入200 ml沸水中，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH 值至7.4，再加熱至95，室溫冷卻并輕輕攪拌，4冰箱放置24

4、h，過(guò)濾，用濾紙將沉淀物水分吸干，放入70干燥箱烘干，取出，刮下粉末，放入研缽內(nèi)研成細(xì)末，得微晶型尿酸鈉，高溫滅菌。用前以無(wú)菌生理鹽水配成100 mg/ml的混懸液。 2.2 模型制備及給藥模型制作參照Coderre介紹的經(jīng)典造模方法略做改進(jìn)2。將48只大鼠隨機(jī)分為4組，每組12只，即空白對(duì)照組（N）、陽(yáng)性藥秋水仙堿組（C）、中藥痛風(fēng)飲組（T）和模型組（M），除空白對(duì)照組外，余三組造模。造模后24 h對(duì)各組灌服治療藥物進(jìn)行觀(guān)察。根據(jù)人用藥量與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥的換算公式，計(jì)算出大鼠的用藥量，T組按13.5 g?kg-1?d-1，C組參照許延文痹清膠囊抗痛風(fēng)作用的實(shí)驗(yàn)研究3中的給藥量，按0.135 m

5、g?kg-1?d-1劑量灌胃，所有藥物分兩次灌胃，共灌胃治療1 d。M組和N組均與T組、C組同一時(shí)間灌服等量生理鹽水作為對(duì)照。 2.3 實(shí)驗(yàn)觀(guān)察 2.3.1 在造模成功后及治療1 d后觀(guān)察各指標(biāo)并登記2。造模后24 h及灌胃治療后24 h測(cè)量站立時(shí)及行走時(shí)患肢壓力積分、步態(tài)積分。 大鼠站立及行走時(shí)患肢壓力積分（A）：后肢正常壓力，兩后肢一樣重量或平等負(fù)重為0分；模型側(cè)后肢負(fù)重輕度減少，完全在地板上，但是趾不分為1分；后肢壓力中度減少，腿屈曲僅有部分肢體負(fù)重，接觸地板為2分；后肢負(fù)重嚴(yán)重減少，甚至患肢完全提起不負(fù)重為3分。 大鼠步行時(shí)患足步態(tài)積分（B）：正常步態(tài)為0分；輕度跛行，注射尿酸鈉的下肢

6、屈曲為1分；中度跛行，注射尿酸鈉的下肢接觸地板為2分；嚴(yán)重跛行，甚至出現(xiàn)3 肢行走步態(tài)，注射肢不負(fù)重為3分。 2.3.2 右后足踝周徑變化值測(cè)量分別于造模時(shí)、造模后24h及灌胃后24h測(cè)量右后足踝周徑，在第一次測(cè)量時(shí)于測(cè)量處做一標(biāo)記，讀取數(shù)值，多次測(cè)量取平均值，并記錄，計(jì)算造模前后踝周徑差及造模后與治療后踝周徑差，作為踝周徑變化值。 2.4 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)于給藥后24 h斷頭取血，待血液自動(dòng)流出后，用微量吸管采血，放入已加好稀釋液的小試管內(nèi)，用計(jì)數(shù)盤(pán)法進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)；取血4 ml注入干燥試管，4離心3 500 r/min，15 min，分離血漿，置-20，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。IL-1，IL-6含

7、量采用放射免疫法測(cè)定。將大鼠右踝關(guān)節(jié)在10%甲醛中固定48h，0.10 mol/L的硝酸溶液脫鈣，包埋，切片4m， 常規(guī)HE染色，采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。百事通 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS for Windows 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用One-Way ANOVA方差分析，數(shù)據(jù)用s表示；方差不齊的計(jì)量資料以及等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)。 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3.1 一般觀(guān)察整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，N組大鼠雙眼靈活有神，行動(dòng)敏捷，對(duì)周?chē)兓磻?yīng)靈敏；C組、T組、M組大鼠在給予致炎后出現(xiàn)致炎足踝腫脹，走路不穩(wěn)，患足不能著地，蜷臥患足朝上。C組、T組經(jīng)治療后上述癥

8、狀明顯好轉(zhuǎn)。 3.2 造模后實(shí)驗(yàn)觀(guān)察見(jiàn)表12。造模后，患肢壓力及步態(tài)積分、右踝周徑變化值，C組，T組，M組明顯高于N組（P0.05），且C，T，M 3組無(wú)顯著性差異（P0.05）。表1 造模后積分A、B 表2 造模后踝周徑變化值 3.3 痛風(fēng)飲治療后各指標(biāo)的變化見(jiàn)表35。治療后，患肢壓力及步態(tài)積分、周徑變化值， T組較M組變化明顯（P0.05）；血中白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC），中性粒細(xì)胞水平（N），IL-1、IL-6水平，C組、T組明顯低于M組（P0.05）。說(shuō)明痛風(fēng)飲能明顯減輕實(shí)驗(yàn)性大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度，以及患肢站立及行走時(shí)壓力步態(tài)積分，能降低白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及IL-1、IL-6水平。表3 治療后

9、積分A、B 表4 治療后踝周徑變化值與模型組比較，P0.05 3.4 痛風(fēng)飲對(duì)大鼠病理形態(tài)的影響HE染色見(jiàn)到M組滑膜襯里層細(xì)胞明顯增厚，呈“柵欄”狀排列，或不規(guī)則排列，滑膜組織呈絨毛狀或指狀肥大，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，C組、T組均較模型組有所改善。見(jiàn)圖1圖2。 圖1 滑膜（HE400） 圖2 炎細(xì)胞（HE400） 4 討論 從西醫(yī)角度來(lái)分析，目前公認(rèn)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)作是由于尿酸鈉濃度過(guò)高，并超過(guò)了尿酸的溶解度而呈過(guò)飽和狀態(tài)，正常情況下，當(dāng)血pH 7.4，溫度37時(shí)，尿酸鹽的最高溶解度為380mol/L。痛風(fēng)病人典型的足部關(guān)節(jié)炎常在夜間發(fā)作，因此提出了“溫度相關(guān)學(xué)說(shuō)”， 即人體內(nèi)中心體溫與人肢體遠(yuǎn)

10、端及外周關(guān)節(jié)腔內(nèi)溫度之間，有一定梯度，如足趾、耳緣等溫度明顯低于中心體溫，有人測(cè)得膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)溫度約為32，較中心體溫低5，尿酸鹽最高溶解度在30時(shí)為268 mol/L，這意味著?趾關(guān)節(jié)腔內(nèi)尿酸濃度?268mol/L即可能形成結(jié)晶沉淀；痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的自行終止，亦可以溫度解釋。因?yàn)榧毙园l(fā)作時(shí)局部溫度升高，使尿酸鈉溶解度明顯升高，微晶體逐漸溶解吸收，故炎癥逐漸消退。且越來(lái)越多的證據(jù)顯示，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的核心是中性粒細(xì)胞（PMN）介導(dǎo)的炎癥，在正常情況下，組織中少見(jiàn)PMN，而增強(qiáng)的中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘連是急性痛風(fēng)產(chǎn)生的本質(zhì)4，5。激活的PMN在趨化因子作用下與血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）粘附并進(jìn)入組織中

11、，PMN粘附，穿越VEC向炎癥部位游走是急性炎癥損傷過(guò)程的重要特征。IL-1是前炎癥網(wǎng)鏈中的一級(jí)細(xì)胞因子，是調(diào)節(jié)炎癥始動(dòng)因素和炎癥反應(yīng)重要調(diào)節(jié)劑6；IL-6 作為發(fā)熱因子，參與損傷的急性反應(yīng)7。故西醫(yī)對(duì)本病的治療，均以消炎鎮(zhèn)痛為原則。 從中醫(yī)角度來(lái)分析，當(dāng)代中醫(yī)學(xué)認(rèn)為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的主要原因在于先天稟賦不足，脾腎功能失調(diào)，與遺傳、體質(zhì)、飲食、外感、環(huán)境、勞倦等因素有關(guān)，肝腎虧虛，脾失健運(yùn)為本，風(fēng)寒濕熱、痰濁、瘀血閉阻經(jīng)脈為標(biāo)，屬本虛標(biāo)實(shí)之證。根據(jù)中醫(yī)“急則治其標(biāo)”的原則，本民間驗(yàn)方采用1付中藥于急性發(fā)作期服用，其中采用藥物之性味多屬辛溫或辛苦溫之品，醫(yī)學(xué)正傳?痛風(fēng)：“治以辛溫，監(jiān)以辛涼，流散

12、寒濕，開(kāi)通郁結(jié)，使血行氣和，更能慎口節(jié)欲，無(wú)有不安者也。”朱丹溪在格致余論?痛風(fēng)病中也提到：“治法以辛熱之劑，流散寒濕，開(kāi)發(fā)腠理。其血得行，與氣相和，其病自安?！鼻倚辽ⅲ瑴赝?，苦燥，苦泄藥物協(xié)同作用，可使?jié)竦迷飫t開(kāi)，血得熱則行，血行氣和；配以苦味緩泄，可促使邪從大腸而出，其病自解。結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究，辛溫之性的藥物可以使血流加速，升高局部溫度，一方面利于局部的微晶體重新溶解吸收；另一方面通過(guò)促進(jìn)血液循環(huán)，利于局部堆積的病理產(chǎn)物散開(kāi)；再配合苦味藥物的緩泄作用，使形成的病理產(chǎn)物（包括各種炎癥介質(zhì)、致炎細(xì)胞因子）排出體內(nèi)，從而起到加速代謝病理產(chǎn)物的作用。 西藥秋水仙堿為治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎首選的一種

13、特效藥物，為比較本方的治療作用強(qiáng)度，本研究選用秋水仙堿作為對(duì)照組。研究結(jié)果顯示，痛風(fēng)飲具有良好的抑制急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用。本方所用中藥資源廣、價(jià)格廉、毒副作用低，故其在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作期應(yīng)用前景廣闊，并為臨床選方用藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但對(duì)其有效成分析及作用機(jī)制還有待作進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 葉任高,陸再英.內(nèi)科學(xué)M.北京：人民衛(wèi)生出版社,2004：867.2 趙 ?. 中藥治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究A. 廣東中醫(yī)藥大學(xué)碩士論文, 2002, 6.3 許延文. 痹清膠囊抗痛風(fēng)作用的實(shí)驗(yàn)研究A. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)碩士論文, 2005, 26. 4 Terkeltaub R, Ba

14、ird S, Sears P. et al. The murine homolog of the interleukin-8 receptor cxcr-2 isessential for the occurrence of neutrophilic inflammation in air pouch model of acute urate crystal-induced gouty synovitisJ. Arthritis Rheum, 1998, 41(5):900.5 Terkeltaub R. pathogenesis and treatment of crystal-induce

15、d inflammation In: Koopman WJ. Arthritis and allied condi- tions: a text book rheumatologyJ. Baltimore: Williams and Wil kins, 1996, 2085.6 Derevianko A, Damico R, Simms H. Polymorphonuclear Leucocyte(PMN)-derived inflammatory cytokines-regula tion by oxygen tersion and gastric epithelial cells barrier function. Effect associated with the impair