電化學(xué)發(fā)光免疫法定量檢測(cè)乙肝病毒的臨床應(yīng)用

1、電化學(xué)發(fā)光免疫法定量檢測(cè)乙肝病毒的臨床應(yīng)用    中國(guó)是乙型病毒性肝炎的高發(fā)國(guó)家，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，人群發(fā)生率較高，表面抗原攜帶率約為15%nbsp;1nbsp;，乙肝的實(shí)驗(yàn)診斷對(duì)于治療及預(yù)防有重要參考意義.但現(xiàn)常規(guī)使用的ELISA法，對(duì)低濃度HBsAg標(biāo)本前后結(jié)果常不一致，嚴(yán)重影響了臨床的可比性.因此為提高     邱春嫦 ，勞小斌     摘要:目的 了解電化學(xué)發(fā)光法（ECL）檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物的應(yīng)用價(jià)值。 方法 用ELISA法和ECL法平行測(cè)定360例疑似乙肝病人血清乙肝五項(xiàng)標(biāo)志

2、物，并對(duì)ELISA法檢測(cè)為陰性而ECL法檢測(cè)為低濃度HBsAg的標(biāo)本，再用微粒子酶免分析法（MEIA）進(jìn)行復(fù)測(cè)并分析。 結(jié)果 ELISA法和ECL法對(duì)HBsAb、HBeAg、HBeAb三項(xiàng)標(biāo)志物的檢出率無(wú)顯著性差異，但對(duì)HBsAg的檢測(cè)，ECL檢出率明顯高于ELISA法（P<0.05）。ELISA檢測(cè)為陰性而ECL法檢測(cè)為低濃度HBsAg的標(biāo)本，用MEIA法復(fù)測(cè)均為陽(yáng)性。 結(jié)論 ECL法檢測(cè)血清乙肝標(biāo)志物的靈敏度和自動(dòng)化程度均比ELISA法高，同時(shí)可動(dòng)態(tài)觀察療效和監(jiān)測(cè)病情。       關(guān)鍵詞:電化學(xué)免疫分析法;乙肝標(biāo)志物;臨床應(yīng)用  &

3、#160;     Clinical application of hepatitis B virus attribute detected by electrical chemiluminescence immunoassay（ELC）.   QIU Chun-chang，LAO Xiao-bin.   （Laboratory Department of First Affiliated Hospital of Jinan University，Guangzhou510630，Guang-dong，P.R.China）   Abst

4、ract:Objective To understand the theory，the advantage and the clinic application of HBV determined by electrical chemiluminescence immunoassay（ECL）. Methods Five types of HBV in the serum of360cases have been determined directly by ELISA and ECL，the samples which are negative determined by ELISA how

5、ever are positive with low concentration of HBsAg should be determined again by MEIA method.At last the results determined by ELISA and ECL are processed by one-to-one 2 test with SPSS10.0statistics software. Results The result is that the rate of detection of HBsAb，HBeAg and HBeAb are have no disti

6、nct difference determined directly by ELISA and ECL.but the rate of detection of HBsAg determined by ECL is higher than that deter-mined by ELISA（P<0.05），and the rate of detection of HBcAb is have distinct difference（P<0.01）.The results determined a-gain by MEIA are all positive of HBsAg. Conc

7、lusion The degree of sensitive and automation determined by ECL are higher than that of ELISA，at the same time the curative effect of patients is be easily dynamic observed and the state of illness is also be easily in-spected by the method of ECL.       Key words:Electrical chem

8、iluminescence immunoassay analysis method;Hepatitis B virus attribute;Clinic application   中國(guó)是乙型病毒性肝炎的高發(fā)國(guó)家，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，人群發(fā)生率較高，表面抗原攜帶率約為15% 1 ，乙肝的實(shí)驗(yàn)診斷對(duì)于治療及預(yù)防有重要參考意義.但現(xiàn)常規(guī)使用的ELISA法，對(duì)低濃度HBsAg標(biāo)本前后結(jié)果常不一致，嚴(yán)重影響了臨床的可比性.因此為提高乙肝實(shí)驗(yàn)診斷方法的靈敏度、精確度和減少勞動(dòng)強(qiáng)度，現(xiàn)試以電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（ECL）進(jìn)行檢測(cè)，并與ELISA平行比較分析評(píng)價(jià)。   1 材料和方法

9、60;     1.1 材料及主要儀器 收集360例疑似乙肝病人靜脈血樣離心，分離出血清待測(cè);ELISA法測(cè)定乙肝“兩對(duì)半”試劑盒由上海實(shí)業(yè)科華生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，使用美國(guó)Bio-rad680型酶標(biāo)儀和1575型洗板機(jī);ECL法儀器和試劑采用德國(guó)羅氏公司生產(chǎn)的Elec-sys2010電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀和其配套試劑產(chǎn)品;微粒子酶免法（MEIA）儀器和試劑采用美國(guó)雅培全自動(dòng)酶免分析儀AxSYM及其配套試劑產(chǎn)品;乙肝五項(xiàng)標(biāo)志物的定值參比血清由國(guó)家衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供。   1.2 方法       1.2.1 電化

10、學(xué)發(fā)光法（ECL）（以雙抗體夾心法為例）其原理為化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕Ru（bpy）3 2+ 和電子供體三丙胺（TPA）在陽(yáng)電極表面可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。二價(jià)Ru（bpy）3 2+ 被氧化成三價(jià)強(qiáng)氧化劑。TPA失去電子后被氧化成陽(yáng)離子自由基TPA + ，其不穩(wěn)定，可自發(fā)地失去一個(gè)質(zhì)子（H+），形成自由基TPA，變?yōu)閺?qiáng)還原劑，可將一個(gè)電子遞給三價(jià)的Ru（bpy）3 3+ 使其形成激發(fā)態(tài)的Ru（bpy）3 2+ 。激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕不穩(wěn)定，很快發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)620nm的光子，回復(fù)成基態(tài)的三聯(lián)吡啶釕。這過(guò)程可以在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，使信號(hào)增強(qiáng).將待測(cè)樣本與包被的順磁性微粒

11、和發(fā)光劑標(biāo)記的抗體加在反應(yīng)杯中共同溫育，形成磁性微珠包被抗體-抗原-反光劑標(biāo)記抗體復(fù)合物。將復(fù)合物吸入流動(dòng)室，同時(shí)用TPA緩沖液沖洗。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時(shí)，被安裝在電極下面的磁鐵吸引住，而游離的發(fā)光劑標(biāo)記抗體被沖走。同時(shí)在電極加電壓，啟動(dòng)ECL反應(yīng)，使Ru（bpy）3 2+ 和TPA在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光。光的強(qiáng)度與待測(cè)抗原的濃度成正比 2 。       1.2.2 采用ELISA法 3 和ECL法 2，4 檢測(cè)收集的血清標(biāo)本的乙肝五項(xiàng)標(biāo)志物，每次以定值參比血清作為質(zhì)控。對(duì)ELISA檢測(cè)為陰性而ECL法檢測(cè)出為低濃度HBsAg的標(biāo)本

12、用MEIA法進(jìn)行復(fù)測(cè)。具體操作均按其儀器和試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。       1.2.3 使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)ELISA和ECL兩種方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行配對(duì) 2 檢驗(yàn)。   2 結(jié)果       2.1 ELISA與ECL法檢測(cè)乙肝標(biāo)志物的結(jié)果見表1。表1 ELISA法檢測(cè)乙肝標(biāo)志物的結(jié)果在ECL法的表現(xiàn)（略）注:P<0.05;P<0.01       2.2 用MEIA法對(duì)ELISA檢測(cè)為陰性而ECL法檢測(cè)出為低濃度HBsAg的9例標(biāo)本，占進(jìn)行中和

13、確證試驗(yàn)，中和率均>50%，確定HBsAg結(jié)果均為陽(yáng)性。       2.3 衛(wèi)生部定值血清HBsAg項(xiàng)室內(nèi)質(zhì)控CV值:ELISA法批內(nèi)3%5%，批間5%10%，而ECL法批內(nèi)小于3%，批間小于5%。   3 討論       3.1 ELISA與ECL法檢測(cè)乙肝五項(xiàng)指標(biāo)的結(jié)果中，HBsAb、HBeAg、HBeAb三項(xiàng)標(biāo)志物的檢出率無(wú)顯著性差異，但HBsAg的檢出率高于ELISA法（P<0.05），而HBcAb的檢出率則有顯著性差異（P<0.01）。從方法學(xué)角度看Elecsys系統(tǒng)使用固

14、相載體為順磁性微粒，直徑2.8m，由于顆粒體積小，比相同體積塑料珠的表面積大，因此擴(kuò)大了反應(yīng)面積，同時(shí)由于標(biāo)志物的循環(huán)利用，使發(fā)光時(shí)間延長(zhǎng)，強(qiáng)度增加，大大提高了檢測(cè)靈敏度 2 ，所以可檢出人群中低濃度的表面抗原（小于1g·L -1 ）和自然感染獲得的乙肝核心抗體。       3.2 Elecsys全自動(dòng)免疫分析儀通過(guò)儀器所帶計(jì)算機(jī)編程制實(shí)現(xiàn)加樣分析、報(bào)告、質(zhì)控和故障檢出等過(guò)程的自動(dòng)化，且順磁性微粒在磁場(chǎng)中緊貼在電極上，易進(jìn)行結(jié)合相和游離相的分離和洗滌，同時(shí)由于使用配套試劑使人為因素減至最低，提高了方法的穩(wěn)定性和結(jié)果的重復(fù)性，減少了污染機(jī)會(huì)。而

15、手工ELISA法由于手工加樣，孵育時(shí)間的控制，洗板等因素影響則容易造成低濃度的乙肝標(biāo)志物結(jié)果不穩(wěn)定。       3.3 ECL法對(duì)乙肝血清標(biāo)志物的定量檢測(cè)，靈敏度高，HBsAg可測(cè)至0.05g·L -1 ，故對(duì)急性乙肝能及早檢出HBsAg，確證乙肝病毒感染，在病程觀察中大大縮短“窗口期”時(shí)間。另外，電化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)，克服了定性對(duì)灰區(qū)結(jié)果的判斷困難，對(duì)灰區(qū)結(jié)果能做出明確客觀的評(píng)價(jià)和判斷，能為醫(yī)生對(duì)病情療效做出合理的解釋，并且指導(dǎo)治療，更有利于醫(yī)患溝通。       3.4 在乙肝表面抗體的檢測(cè)上，EC

16、L法為定量結(jié)果，能夠?qū)C(jī)體是否真正具有抵抗HBV的免疫力做出正確評(píng)價(jià)，避免誤導(dǎo)。Anti-HBs定量在10100IU·L -1 之間的標(biāo)本，ELISA結(jié)果為陽(yáng)性，但此時(shí)抗體對(duì)HBV并無(wú)中和作用，仍有感染HBV的危險(xiǎn).只有“定量”在100IU·L -1 以上時(shí)才具有抵抗HBV入侵的作用 5 ，因此對(duì)乙肝疫苗免疫力的評(píng)價(jià)和高危人群預(yù)防免疫具有重要意義。從方法學(xué)角度和自動(dòng)化程度看，ECL法技術(shù)均優(yōu)于ELISA法，但由于儀器、試劑較貴，醫(yī)院可根據(jù)各自的工作實(shí)際、經(jīng)濟(jì)能力選用。   參考文獻(xiàn):   1陳慧英，張錦鋒，岑小鵬，等.ELISA檢測(cè)乙型肝炎HBsAg室內(nèi)

17、質(zhì)控血清的試劑和使用J.上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2000，15（4）:203205.       2吳健民主編.臨床化學(xué)自動(dòng)化免疫分析M.第1版.北京:科學(xué)出版社，2000:241243.       3葉應(yīng)嫵，王毓三主編.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程M.第二版.南京:東南大學(xué)出版，1997，410414.       4Duchna W，Hafner G，Navarro J，et al.1988.International multicenter evalu-ation of ELECSYS ? Ferritin on the ELECSYS ? 2010and1010analyzerJ.Clinical Chemistry，44（Suppl）:A47.       5Heijtink RA，Schneeberger PM，Postma B，et