供體神經(jīng)雷公藤預(yù)處理對異體移植后神經(jīng)再生的影響

1、供體神經(jīng)雷公藤預(yù)處理對異體移植后神經(jīng)再生的影響         10-05-04 09:20:00     編輯：studa20                      作者：黃英如，蔣電明陳路，蔣華【摘要】  目的 探討雷公藤多甙(雷公藤提取物)或MEM預(yù)

2、處理的供體坐骨神經(jīng)對異體周圍神經(jīng)缺損修復(fù)的影響。方法用新鮮異體坐骨神經(jīng)移植(A組)或雷公藤多甙(B、C組)/MEM(D、E組)預(yù)處理的Wistar大鼠坐骨神經(jīng)，橋接SD大鼠10 mm坐骨神經(jīng)缺損，術(shù)后以雷公藤多甙治療5周：A、C、E組5 mg/(kg·d)，B、D組2.5 mg/(kg·d)。術(shù)后2周觀察移植物炎癥反應(yīng)情況，12周電生理檢測和組織學(xué)觀察神經(jīng)再生，16周觀察靶肌肉運動終板。結(jié)果術(shù)后早期炎癥反應(yīng)D組比其它組嚴(yán)重;運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度、動作電位潛伏期，再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量和軸突直徑、髓鞘厚度，C組優(yōu)于A、B、E組(P<0.05)，A、B、E組則優(yōu)于D組(P<

3、;0.05);運動終板染色著色和數(shù)量，D組明顯比其它組差。結(jié)論供體神經(jīng)經(jīng)雷公藤多甙預(yù)處理可能降低了神經(jīng)組織免疫原性，異體移植后能促進神經(jīng)再生，減少移植后受體免疫抑制劑用量。 【關(guān)鍵詞】  雷公藤多甙 神經(jīng)移植 同種異體 預(yù)處理 神經(jīng)再生Abstract：ObjectiveTo investigate the repairing effects of pretreated donor sciatic nerve with Tripterygium glycoside(TG) or minimum essential media (MEM) on peripheral nerve def

4、ect.MethodSD rats sciatic nerve 10 mm gap was repaired by Wistar rats fresh sciatic nerve(Group A ) or TG pretreated sciatic nerve(Group B and C)/ MEM pretreated sciatic nerve(Group D and E). SD rats were given TG for 5 weeks after operation, Groups A, C and E were given 5 mg/(kg·d) and Groups

5、B and D were given 2.5 mg/(kg·d). At 2 weeks after operation, inflammatory reaction of the allografts was observed ，the regenerated nerves were observed by electrophysiological and histological tests at 12 weeks after operation, and the motor end plates were observed at 16 weeks after operation

6、.ResultAt postoperative initial stage, the inflammatory reaction in Group D was more severe than those in the other Groups. Group C had more significant differences in the conduction velocity, the latent period of motor nerve, the number of regenerated myelinated nerve fibers, the axon diameter and

7、the thickness of myelin sheath than Groups A, B and E (P<0.05), and Groups A, B and E were more significant than Group C (P<0.05). The motor end plates of Group D were worse than those of the other Groups.ConclusionThe immunogenicity of pretreated donor sciatic nerve using TG may be decreased.

8、 It could promote neural regeneration and reduce dosage of immunosuppressant of recipient after nerve allograft.Key words：tripterygium glycoside(TG); nerve transplantation; allograft; retreatment; neural regeneration自體神經(jīng)移植由于神經(jīng)來源有限，增加創(chuàng)傷和出現(xiàn)新的神經(jīng)功能障礙區(qū)，而同種異體神經(jīng)與自體神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)相同，應(yīng)是自體神經(jīng)較理想替代品，但異體神經(jīng)移植存在排斥反應(yīng)。中藥雷公藤具

9、有抗排斥反應(yīng)作用，能保護小鼠異體移植心臟，減少移植物中炎癥細胞浸潤1，下調(diào)抗原呈遞細胞(APC)膜表面主要組織相容性抗原復(fù)合體(MHC)分子和共刺激分子表達，削弱APC抗原提呈功能和對T淋巴細胞的激活作用2，3。同種異體周圍神經(jīng)移植后服用雷公藤制劑，神經(jīng)功能恢復(fù)良好4;供體皮膚用雷公藤制劑預(yù)處理后行同種異體移植，其排斥反應(yīng)減輕，移植皮膚存活時間延長5。本實驗建立大鼠同種異體坐骨神經(jīng)移植模型，觀察供體神經(jīng)經(jīng)雷公藤多甙預(yù)處理和MEM預(yù)處理對異體神經(jīng)移植后神經(jīng)再生的影響有無差別，并探討供體神經(jīng)預(yù)處理對異體移植后受體免疫抑制劑用量的影響。1 材料與方法1.1 實驗動物與分組成年健康Wistar大鼠為供

10、體，受體選擇成年健康SD大鼠，供、受體均為雄性(重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，體重200250 g。取受體60只，用隨機數(shù)字表法分成A、B、C、D、E組，每組12只，A組為新鮮異體坐骨神經(jīng)移植，B、C組為供體神經(jīng)經(jīng)雷公藤多甙預(yù)處理后再移植，D、E組為單純細胞培養(yǎng)基(MEM)預(yù)處理后移植。術(shù)后次日服用雷公藤多甙5周：A、C、E組5.0 mg/(kg·d)，B、D組2.5 mg/(kg·d)。1.2 雷公藤多甙溶液配制與供體神經(jīng)預(yù)處理取400 mg雷公藤多甙片，碾為細末溶于1 000 ml 細胞培養(yǎng)基MEM中，并依次加入谷胱甘肽(還原型)0.31 g、羥乙基哌嗪乙磺酸3.57

11、 g，反復(fù)攪拌密封置45冰箱中過夜，微孔濾膜(0.22 m)抽濾除菌，制成含雷公藤多甙400 mg/L的預(yù)處理溶液，滲透壓(300±10)mmol/L，pH值7.30±0.10。無菌條件下，用消毒剃須刀切取供體坐骨神經(jīng)20 mm長，生理鹽水沖洗，立即置于已預(yù)冷的雷公藤多甙溶液或MEM溶液(除不含雷公藤多甙外，其余成分均與雷公藤多甙溶液相同)中， 在45冰箱中保存24 h備用。1.3 手術(shù)方法采用3.5%水合氯醛腹腔麻醉，右股后外側(cè)縱行切口，上起骨盆后緣，長約30 mm左右，沿肌間隙鈍性分離，將股外側(cè)肌、外展短肌與股二頭肌分開，顯露坐骨神經(jīng)。距梨狀肌下孔5 mm處，用消毒剃須

12、刀片整齊切除大鼠坐骨神經(jīng)形成10 mm缺損。將新鮮或經(jīng)預(yù)處理的供體坐骨神經(jīng)修成10 mm長，在10倍手術(shù)顯微鏡下，吻合SD大鼠坐骨神經(jīng)10 mm缺損，用10-0尼龍線行神經(jīng)外膜無張力間斷縫合46針，逐層縫合切口。手術(shù)1人完成，術(shù)后大鼠不做特殊處理。1.4 觀測指標(biāo)與方法1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行處理，所有數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較用q檢驗，以P<0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。2 結(jié) 果2.1 大體觀察術(shù)后均出現(xiàn)右后肢癱瘓，足趾并攏、拖步行走。10周左右動物行走跛行減輕，后蹬有力，但D組大鼠跛行仍較明顯，觀察期間無潰瘍、傷口感染和死亡。術(shù)后1

13、2周D組移植段神經(jīng)與周圍組織粘連明顯，遠近端吻合口形成輕度膨大(神經(jīng)瘤)，其余組移植段神經(jīng)與周圍組織輕微粘連，吻合口未見神經(jīng)瘤。2.2 移植物光鏡觀察術(shù)后2周HE染色發(fā)現(xiàn)，D組入侵移植神經(jīng)的炎癥細胞明顯比其它組多、炎癥反應(yīng)更重(圖1、2)，C組炎癥反應(yīng)最輕，而A、B、E組則相似。2.3 神經(jīng)電生理術(shù)后12周，再生神經(jīng)動作電位潛伏期和神經(jīng)傳導(dǎo)速度，A、B、E組與C組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(q=2.934.57，3.714.68;P<0.05)，與D組比較也有統(tǒng)計學(xué)差異(q=3.084.45，3.614.72;P<0.05)，而A、B、E三組間無差異(q=0.871.83，0.611.92;

14、P>0.05)，結(jié)果見表1。表1 術(shù)后12周神經(jīng)電生理檢測組別潛伏期     10-05-04 09:20:00     編輯：studa202.4 再生軸突圖像分析移植神經(jīng)中段組織HE染色光鏡照片(400倍)，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)目、軸突直徑和髓鞘厚度，A、B、E組與C組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(q=3.194.76，3.374.11，2.953.91;P<0.05)，與D組比較同樣有統(tǒng)計學(xué)意義(q=3.124.29，3.064.42，3.284.06;P<0.05)，而A、B、E

15、 3組間無差異(q=0.951.30，0.721.51，0.841.34;P>0.05)，結(jié)果見表2。表2 術(shù)后12周再生神經(jīng)纖維圖像分析組別神經(jīng)纖維數(shù)2.5 電鏡觀察移植術(shù)后12周，A、B、C、E組再生神經(jīng)纖維中，可見較多有髓神經(jīng)纖維和少量無髓神經(jīng)纖維，髓鞘發(fā)育良好，呈同心圓排列，軸漿內(nèi)微絲、微管和線粒體等細胞器豐富;D組再生神經(jīng)纖維中，有髓神經(jīng)纖維較少，而無髓神經(jīng)纖維較多，神經(jīng)纖維間可見增生的結(jié)締組織(圖3、4)。2.6 靶肌肉運動終板光鏡下正常運動終板AchE陽性區(qū)呈棕紅色或深棕色的“梅花形”或“卵圓形”，直徑2530 m，結(jié)構(gòu)清楚、邊緣光滑，著色深。神經(jīng)移植后16周，A、B、C、

16、E組的終板接近正常，外形較大且規(guī)則，數(shù)量較多，呈深棕褐色(尤其C組最好);而D組終板形狀較小且數(shù)量少，著色較淺(圖5、6)。圖1 術(shù)后2周B組移植段神經(jīng)組織學(xué)變化 HE×400 圖2 術(shù)后2周D組移植段神經(jīng)組織學(xué)變化 HE×400 圖3 術(shù)后12周B組再生神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)(箭頭所示有髓神經(jīng)纖維) 圖4 術(shù)后12周D組再生神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)TEM×10 000(箭頭所示有髓神經(jīng)纖維) TEM×10 000 圖5 術(shù)后16周B組運動終板(箭頭所示AchE陽性區(qū))KarnovskyRoots法×400 圖6 術(shù)后16周D組運動終板(箭頭所示AchE陽性區(qū))Ka

17、rnovskyRoots法×4003 討 論異體神經(jīng)移植的主要問題是排斥反應(yīng)，MHC是移植免疫病理的核心，其中MHC-II是APC呈遞抗原的關(guān)鍵分子，然而周圍神經(jīng)組織的雪旺氏細胞(SCs)、神經(jīng)外膜和束膜細胞、血管內(nèi)皮細胞等都能表達MHC-II分子。為了克服異體神經(jīng)移植后宿主的排斥反應(yīng)，除術(shù)后對宿主進行免疫抑制治療外，人們探索用不同方法(物理或化學(xué)法)對供體神經(jīng)進行預(yù)處理，滅活或清除神經(jīng)組織細胞成分，以降低異體神經(jīng)的免疫原性，而引導(dǎo)軸突再生并起支架作用，具有三維空間結(jié)構(gòu)的基膜管保持不變68。然而，SCs是周圍神經(jīng)的主要結(jié)構(gòu)與功能細胞，在軸突再生與髓鞘形成、神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTFs)和黏

18、附分子以及細胞外基質(zhì)的合成與分泌均極為重要，滅活、清除SCs勢必會影響軸突再生，而在去細胞異體神經(jīng)移植物內(nèi)種植SCs后則促進神經(jīng)再生9。在本實驗中，雷公藤多甙(B、C組)/MEM(D、E組)預(yù)處理的大鼠坐骨神經(jīng)異體移植后服用不同劑量的雷公藤多甙，術(shù)后2周D組的炎性細胞入侵明顯要比其它組嚴(yán)重，而移植后12周電生理和組織學(xué)檢測、16周靶肌肉運動終板染色，均顯示D組要比其它組差，C組最好，A、B、E組差別不明顯。其原因可能是：(1)雷公藤多甙預(yù)處理后，降低了供體坐骨神經(jīng)的免疫原性，而神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)未受影響，異體移植后免疫反應(yīng)減輕，有利于少量入侵的炎癥細胞產(chǎn)生促進SCs增殖分化的細胞因子，而SCs增殖并

19、形成Bungner帶是新生軸突得以延長進入移植段神經(jīng)、并最終能到達靶器官的前提。而MEM預(yù)處理神經(jīng)組織免疫原性未發(fā)生改變，因而異體移植后D組與A、B、C組相比，出現(xiàn)大量單核細胞、淋巴細胞入侵移植物，入侵的炎癥細胞將SCs作為抗原清除，破壞移植物的組織結(jié)構(gòu)，神經(jīng)基膜管塌陷，成纖維細胞增殖，纖維結(jié)締組織增生，影響了再生軸突通過。而雷公藤能抑制成纖維細胞增殖和膠原纖維的合成10，故E組在D組基礎(chǔ)上，增加術(shù)后雷公藤多甙劑量，其效果則明顯好于D組，與A、B、C組相似，神經(jīng)再生情況良好，未見明顯結(jié)締組織增生;(2)預(yù)處理后SCs仍具生物活性11，功能正常的SCs能分泌多種NTFs與黏附分子，且具有神經(jīng)趨化

20、性，能引導(dǎo)軸突生長錐生長12。移植物上具生物活性的SCs繼續(xù)發(fā)揮促進軸突再生的作用，但是D組在預(yù)處理后未改變移植神經(jīng)的免疫原性，術(shù)后免疫抑制劑用量偏低，SCs被排斥而影響了神經(jīng)再生;(3)供體神經(jīng)組織所吸收的預(yù)處理溶液中的藥物成分，在異體移植后的一定時間內(nèi)發(fā)揮了免疫抑制作用，從而降低術(shù)后免疫抑制劑用量。供體神經(jīng)雷公藤多甙預(yù)處理與受體服用免疫抑制劑，可能有協(xié)同作用，異體移植后能促進神經(jīng)再生并降低術(shù)后免疫抑制劑用量，這對臨床減輕或避免全身大劑量免疫抑制劑所引起的毒副作用有重要意義。當(dāng)然，預(yù)處理溶液中雷公藤多甙最佳濃度與處理時間，這種方法對供體神經(jīng)免疫原性具體影響、對生物體安全性的影響等還需要進一步

21、研究?！緟⒖嘉墨I】  1 Tang W, Zhou R, Yang Y, et al. Suppression of (5R)5hydroxytriptolide (LLDT-8) on allograft rejection in full MHCmismatched mouse cardiac transplantation J. Transplantation, 2006,6:927-933.2 Liu J, Wu QL, Feng YH, et al.Triptolide suppresses CD80 and CD86 expressions and IL-12 production in THP-1 cellsJ. Acta Pharmacol Sin, 2005,2:223-237.3 Li H, Liu ZH, Dai CS, et al. Triptolide inhibits proinflammatory factorinduced overexpression of class II MHC and B7 molecules in renal tubular epithelial cellsJ. Acta Pha