MycoGuard_ Mycoplasma Bioluminescent Detection Kit

1、GeneCopoeia Inc. 9620 Medical Center Drive, Suite 101Rockville, MD20850, USA Tel: +1(301)762-0888;Toll free: +1(866)360-9531Fax:+1(301)762-3888Web: 使用說明書MycoGuardTM Mycoplasma Bioluminescent Detection Kit產(chǎn)品編號(hào)MPD-E-010/ MPD-E-050產(chǎn)品內(nèi)容包裝規(guī)格(10 Rxns / 50 Rxns)儲(chǔ)存條件Myco Detection Mix1 mL /1 mL×5-20

2、76;C或-80°C保存6個(gè)月Myco- Sub0.5 mL /0.5mL×5-20°C或-80°C保存6個(gè)月Myco-positive100µL /500µL-20°C或-80°C保存6個(gè)月注：如需要更多陽性對照，可單獨(dú)購買Myco-positive。單獨(dú)出售的Myco-positive包裝規(guī)格為1mL。陽性對照不含支原體， 無支原體污染的潛在危險(xiǎn)。n 產(chǎn)品簡介MycoGuardTM Mycoplasma Bioluminescent Detection Kit應(yīng)用了一種高效的、選擇性的生物化學(xué)檢測，通過檢測在支

3、原體中特定酶的活性，從而測得樣本中存在的支原體。原理：支原體被溶解后，釋放到培養(yǎng)基的支原體酶與MycoGuardTM底物相互反應(yīng)，可催化ADP轉(zhuǎn)換為ATP。ATP含量的變化可通過生物發(fā)光的原理檢測，由ATP激發(fā)的熒光強(qiáng)度與ATP濃度呈線性關(guān)系。通過計(jì)算樣本在添加底物前和添加底物后的ATP比率，可判斷樣品中是否存在支原體。n 應(yīng)用范圍支原體污染是細(xì)胞傳代及培養(yǎng)中的常見問題。支原體是最小、最簡單的原核生物，由于自身缺乏生物合成功能，支原體通常依靠與細(xì)胞競爭培養(yǎng)基中的養(yǎng)分存活，易導(dǎo)致細(xì)胞增殖速度減慢、改變基因表達(dá)、代謝特征及細(xì)胞形態(tài)等，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性、可靠性和準(zhǔn)確性。支原體很難檢測，傳統(tǒng)的支原

4、體檢測方法需耗費(fèi)大量時(shí)間，且無法在早期發(fā)現(xiàn)污染。GeneCopoeia推出的MycoGuardTM檢測試劑盒可快速、簡單檢測出細(xì)胞培養(yǎng)過程中存在的支原體，便于監(jiān)控細(xì)胞培養(yǎng)過程，或?yàn)榕囵B(yǎng)基中的各組分進(jìn)行常規(guī)檢測。保證測試頻率可以及時(shí)反映細(xì)胞受支原體污染的準(zhǔn)確時(shí)間，以便及時(shí)采取清除支原體的措施，我們建議在每次細(xì)胞傳代后進(jìn)行一次測試。n 產(chǎn)品優(yōu)勢操作時(shí)間短：半小時(shí)內(nèi)即可完成實(shí)驗(yàn)操作及檢測過程；靈敏度高：添加底物前，熒光數(shù)值穩(wěn)定；添加底物后，熒光數(shù)值在10分鐘內(nèi)快速增長，10分鐘后呈現(xiàn)穩(wěn)定的上升趨勢線性關(guān)系（圖2）；穩(wěn)定性強(qiáng)：在不同的孵育時(shí)間條件下，（圖3）圖1. MycoGuardTM支原體檢測試劑

5、盒與某公司同類試劑盒的靈敏度對比 兩家公司的產(chǎn)品分別檢測添加陽性對照(Acetyl Kinase)的DMEM培養(yǎng)基以及不添加陽陰性對照的培養(yǎng)基。GeneCopoeia（GCI）支原體檢測試劑盒在陰性對照(綠)中，添加底物后仍表現(xiàn)穩(wěn)定；在陽性對照(紅)中，添加底物后有較明顯的數(shù)值攀升，且數(shù)值上升趨勢穩(wěn)定。某公司同類產(chǎn)品在陰性對照(淺藍(lán))中，添加底物后有一定的數(shù)值波動(dòng)；在陽性對照(深藍(lán))中，添加底物后的數(shù)值變化不如GeneCopoeia支原體檢測試劑盒明顯。圖2. MycoGuardTM支原體檢測試劑盒的穩(wěn)定性測試 待檢樣品分為5組，各組添加相同濃度梯度的支原體酶底物，分別孵育10/20/30/4

6、0/50分鐘后檢測熒光數(shù)值。從上圖可知，GeneCopoeia支原體檢測試劑盒在不同的孵育時(shí)間下，底物支原體酶濃度的增長與熒光讀數(shù)的增長均呈現(xiàn)平穩(wěn)而一致的增長趨勢。n 實(shí)驗(yàn)所需儀器及材料化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀、或其它具有l(wèi)uminometer功能的熒光分光光度計(jì)；光度計(jì)比色皿或白色壁、底部不透明的微孔板；10 mL無菌槍頭；50-200 µL移液器、200-1000 µL移液器。n 樣品準(zhǔn)備我們推薦使用新鮮取樣的細(xì)胞培養(yǎng)液作為樣品。用作樣品的細(xì)胞培養(yǎng)液以1500 rpm (200 g)離心5分鐘，吸取上清液用于檢測。提醒：對細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行離心是為了徹底去除培養(yǎng)液中的殘留細(xì)胞。樣品中

7、殘留的細(xì)胞會(huì)使背景增高，影響檢測靈敏度和分辨率，不利于檢測較輕微程度的支原體污染。A. 新鮮取樣的細(xì)胞培養(yǎng)液（推薦）1. 懸浮細(xì)胞取樣：進(jìn)行傳代時(shí)取培養(yǎng)液；2. 貼壁細(xì)胞取樣：進(jìn)行消化前取培養(yǎng)液；3. 復(fù)蘇細(xì)胞取樣：凍存細(xì)胞添加進(jìn)新鮮的全培養(yǎng)基，培養(yǎng)1-2小時(shí)后取培養(yǎng)液。提醒：細(xì)胞剛傳代后或消化后，支原體檢測信號(hào)將會(huì)降低。如在細(xì)胞傳代或消化后取樣檢測，需在傳代或消化完畢的24小時(shí)后取樣。B. 以低溫保存的細(xì)胞培養(yǎng)液一般情況下，我們建議采用新鮮取樣的培養(yǎng)液作為樣品。如取樣后暫未能檢測，樣品可在4保存5天以內(nèi)。檢測前將樣品靜置在室溫環(huán)境，待樣品溫度回復(fù)到室溫后即可進(jìn)行檢測。n 實(shí)驗(yàn)步驟1. 從冰箱

8、取出所有試劑，室溫靜置，使試劑回復(fù)到室溫；（提醒：當(dāng)試劑從冰箱取出后，使用前須確保試劑已恢復(fù)到室溫，請勿以水浴加熱或其它外力為試劑升溫。）2. 取1mL細(xì)胞培養(yǎng)液作為樣本，1500 rpm (200 g)離心5分鐘去除培養(yǎng)液中殘留的細(xì)胞，吸取50 µL上清液至比色皿或微孔板；3. 將熒光酶標(biāo)儀的讀數(shù)時(shí)間設(shè)置為1秒；4. 將100 µLMyco Detection Mix添加到樣品中，混勻后靜置5分鐘；5. 進(jìn)行讀數(shù)，獲得讀數(shù)A；6. 將 50 µL Myco-Sub添加到樣品中，混勻后靜置孵育10分鐘；7. 進(jìn)行讀數(shù)，獲得讀數(shù)B；8. 計(jì)算比率：比率讀數(shù)B

9、7;讀數(shù)A。n 注意事項(xiàng)：1. 本方法的最佳實(shí)驗(yàn)溫度是22。當(dāng)試劑從冰箱取出后，在使用前須確保試劑自然回復(fù)到室溫，請勿以水浴加熱或其它外力為試劑升溫；如需長期存放試劑，推薦根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)用量進(jìn)行分裝，并避免反復(fù)凍融；2. 為保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)前請校準(zhǔn)移液器；3. 推薦在每次實(shí)驗(yàn)中添加陽性及陰性對照；4. 建議處理樣品和進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)佩戴乳膠手套。人的皮膚表面含大量ATP，將可能對樣品造成污染，造成假陰性或假陽性。n 結(jié)果分析比率 (讀數(shù)B÷讀數(shù)A)結(jié)果判斷<0.9陰性，無支原體污染0.9-1.2結(jié)果較可疑，建議24小時(shí)后再次檢測>1.2存在支原體污染根據(jù)細(xì)胞種類及其它實(shí)驗(yàn)條件的差異，比率與結(jié)論之間的關(guān)系可能存在波動(dòng)。通常情況下，受支原體污染的細(xì)胞將獲得>1的比率。如發(fā)現(xiàn)檢測所得比率大于1，推薦在24-48小時(shí)后再次檢測，觀察比率是否有增長趨勢。如幾次檢測的比率一直約等于1，可能與檢測儀器的靈敏度有關(guān)，可將讀數(shù)時(shí)間從1秒調(diào)整到1-10秒之間的區(qū)間，并檢查熒光發(fā)光酶標(biāo)儀的模式是否已