實(shí)驗(yàn)性腦缺血再灌注大鼠外周血CINC的變化

1、    實(shí)驗(yàn)性腦缺血再灌注大鼠外周血CINC的變化        摘要目的：為了探討腦缺血再 灌注外周血細(xì)胞因子介導(dǎo)的粒細(xì)胞趨化因子(CINC)水平的變化，采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法對(duì)實(shí)驗(yàn) 性腦缺血再灌注不同時(shí)間內(nèi)外周血CINC和髓質(zhì)過(guò)氧化物酶(MPO)活性的變化進(jìn)行了觀察。方法：選用改良線栓法復(fù)制Sprague-Dawley(SD)大鼠腦缺血再灌注實(shí)驗(yàn) 模型。對(duì)不同時(shí)間內(nèi)的血清MPO活性及CINC水平進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：?jiǎn)渭內(nèi)毖MMPO活性增高始于缺血6h并于缺血72h時(shí)達(dá)高峰，為0.1

2、5±0.01U/ml; CINC水平 增高始于缺血1h，缺血6h時(shí)達(dá)高峰，為0.05±0.05ng/ml，以后逐漸下降并于缺血48h后 恢復(fù)正常。缺血1小時(shí)再灌注組MPO活性增高始于再灌注1h并于再灌注24h時(shí)達(dá)高峰，為0.42 ±0.12U/ml；CINC水平增高始于再灌注1h，再灌注3h時(shí)達(dá)高峰，為0.65±0.03ng/ml，以后逐漸下降并于再灌注24h后恢復(fù)正常。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)性腦缺血再 灌注外周血CINC有表達(dá)增高改變，其作用過(guò)程可能與白細(xì)胞激活過(guò)程有關(guān)，提示CINC增高 可能在腦缺血再灌注損傷中起一定作用。關(guān)鍵詞細(xì)胞因子介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞化學(xué)吸附劑

3、髓質(zhì)過(guò)氧化物酶腦缺血再灌注 The changes of cytokin-induced neutrophil chemoattractant (CINC) in blood of experimental cerebral ischemia reperfusion with ratsCao Xuebing, Sun Shenggang, Tong Etang et alDepartment of Neurology, the Union Affilated Hospital of Tongji Medical, Unive rsity, Wuhan 430022Abstract Object

4、ive：The purpose of study was to a ssess the changes rule of cytokin-induced neutrophil chemoattractant (CINC). Methods: In different time, the concentrations of CINC and the activities of myeloperioxidase (MPO) were observed in experimental cerebral isc hemia reperfusion model with Sprague-Dawley(SD

5、) rats made by modified thread em bolism method. Results:In ischemia group, the peaks of MPO activity and CINC conentr ation were 24 hour and 6 hour respectively after ischemia, which initially incre ased at 1 hour, In ischemia reperfusion group, the peaks of MPO activity and CIN C conentration were

6、 72 hour and 6 hour respectively after ischemia reperfusion, which initially increased at 6 hour and 1hour down to normal at 24hour respectiv ely. Conclusion: The rise of CINC was an effect of activiting WBC after the ischemia or ischemia reperfusion and indicated that the change was involving in th

7、e damage of ischemia reperfusion.Key words Cytokin-induced neutrophil chemoattractant (CINC ) Myeloperioxidase(MPO) cerebral ischemia/reperfusion細(xì)胞因子介導(dǎo)的粒細(xì)胞趨化因子(CINC)為一種有72個(gè)氨基酸殘基的堿性蛋白，分子量約15.6KD的二聚體。有學(xué)者將CINC稱為IL-8樣中性粒細(xì)胞趨化因子，IL-8與CINC的同源性為47.2%，免疫學(xué)證實(shí)鼠CINC與人IL-8兩者并無(wú)交叉反應(yīng)，它們的趨化作用能力也不同，鼠CINC特異性趨化粒細(xì)胞，又稱為中性

8、粒細(xì)胞特異性趨化因子1。近年來(lái)，白細(xì)胞在急性腦卒中發(fā)病機(jī)制中的作用得到了進(jìn)一步的闡述。至于CINC與腦血管病的發(fā)病關(guān)系尚不十分明確。為了解腦缺血及缺血再灌注后血清CINC的變化規(guī)律，我們利用動(dòng)物模型對(duì)MPO和CINC的變化進(jìn)行了觀察，現(xiàn)報(bào)告如下：材料與方法一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：128只雄性SD大白鼠，由湖北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供，體重225g250g，分為單純?nèi)毖腿毖?小時(shí)再灌注兩部分。單純?nèi)毖糠钟蛛S機(jī)分為對(duì)照組、缺血1、3、6、12、24、48、72小時(shí)(h)共8組。缺血1小時(shí)再灌注兩部分又隨機(jī)分為缺血1h未灌注組、再灌注1、3、6、12、24、48、72h共8組。每組動(dòng)物均為8只。其中每

9、組6只大鼠用作免疫及生化檢測(cè)，其余則用于組織病理學(xué)觀察。二、實(shí)驗(yàn)方法：采用Yuji(1995)2報(bào)道的大白鼠局灶性腦缺血再灌注線栓模型稍加改進(jìn)。麻醉前10分鐘大鼠腹腔注射阿托品(5mg/100g)，麻醉用10%水合氯醛腹腔注射(3040mg/100g)，麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部正中切開(kāi)，逐層分離組織，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，結(jié)扎CCA近端、ECA根部。在CCA結(jié)扎處遠(yuǎn)端剪一斜口，經(jīng)此斜口插入尼龍絲，經(jīng)CCA分叉處通過(guò)ICA入顱至大腦前動(dòng)脈(ACA)以阻斷MCA的血流。尼龍絲平均插入深度為18.5±0.5mm，結(jié)扎ICA以固定尼龍絲和防

10、止出血，縫合皮膚，尼龍絲末端暴露在外。腦缺血未灌注組不拔出尼龍絲使腦組織缺血；再灌注組缺血1h后，拔出尼龍絲再灌注不同時(shí)程。假手術(shù)組除不插入尼龍絲外，其余步驟同腦缺血未灌注組；正常對(duì)照組不作任何處理。三、血樣留取單純?nèi)毖糠址謩e在手術(shù)前及缺血后1、3、6、12、24、48、72h采取靜脈血2ml；缺血1h再灌注部分分別在再灌注1、3、6、12、24、48、72h采取靜脈血2ml。低溫(4)3000rpm分離血清，置-80保存待檢。四、測(cè)試方法：CINC測(cè)定試劑由日本國(guó)崗山大學(xué)免疫系李君武博士贈(zèng)送，抗體效價(jià)為11000，CINC標(biāo)準(zhǔn)品濃度為100ng/ml。按ELISA法測(cè)定血清中CINC水平。

11、MPO活性測(cè)定用Barone等3報(bào)道的方法。MPO活性用標(biāo)準(zhǔn)溶液計(jì)算。IUMPO定義為：25下每分鐘分解1mol過(guò)氧化物。五、統(tǒng)計(jì)方法：分別計(jì)算不同時(shí)間測(cè)定后的結(jié)果平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，并與對(duì)照組比較行t-檢驗(yàn)。結(jié)果一、不同缺血時(shí)間血清中MPO活性、CINC水平的變化(表1)：表1不同缺血時(shí)間MPO活性(U/ml)、CINC水平(ng/ml)的變化缺血前缺血后1h3h6h12h24h48h72hMPO0.01±0.0020.01±0.0020.01±0.0020.01±0.002*0.05±0.01*0.08±0.01*0.10±

12、0.005*0.15±0.01*CINC00.06±0.020.15±0.05*0.55±0.05*0.25±0.06*0.11±0.04*0.06±0.030本項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果看，MPO活性增高始于缺血6h并于缺血72h時(shí)達(dá)高峰，為0.15±0.01U/ml。缺血6h以上各組MPO活性與缺血前比較，差異均有極顯著性意義(P<0.01，見(jiàn)表1)。CINC水平增高始于缺血1h，缺血6h時(shí)達(dá)高峰，為0.55±0.05ng/ml，以后逐漸下降并于缺血48h后恢復(fù)正常。缺血3h以上各組血清CINC水平均高于缺血1

13、h組，差異均有極顯著性意義(P<0.01,見(jiàn)表1)。 表2缺血1小時(shí)不同再灌注時(shí)間MPO活性(U/ml)、CINC水平(ng/ml)的變化缺血1h再灌注后1h3h6h12h24h48h72hMPO0.01±0.0020.04±0.005*0.08±0.005*0.10±0.01*0.20±0.02*0.42±0.12*0.35±0.08*0.12±0.01*CINC0.06±0.020.25±0.05*0.65±0.03*0.32±0.04*0.16±0.02

14、*0.11±0.01*0.06±0.030二、缺血1小時(shí)不同再灌注時(shí)間MPO活性、CINC水平的變化(表2)：本項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果看，MPO活性增高始于再灌注1h并于再灌注24h時(shí)達(dá)高峰，為0.42±0.12U/ml。再灌注1h以上各組MPO活性與缺血1h比較，差異均有極顯著性意義(P<0.01，見(jiàn)表2)。CINC水平增高始于再灌注1h，再灌注3h時(shí)達(dá)高峰，為0.65±0.03ng/ml，以后逐漸下降并于再灌注24h后恢復(fù)正常。再灌注1h至24h各組血清CINC水平均高于缺血1h組，差異均有極顯著性意義(P<0.01，見(jiàn)表2)。 討論炎性細(xì)胞在缺血組

15、織的聚集是腦缺血后導(dǎo)致功能殘跡的重要因素之一。淋巴細(xì)胞活化并通過(guò)血腦屏障遷移入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)制尚未完全清楚。炎性過(guò)程被認(rèn)為由局部產(chǎn)生的前炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-、IL-1和IL-6所誘導(dǎo)的4。這些細(xì)胞因子還對(duì)培養(yǎng)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞具有誘導(dǎo)作用并能增強(qiáng)幾種粘附分子包括細(xì)胞間粘附分子-1，血管性細(xì)胞粘附分子-1和E-選擇素表達(dá)的能力。而且，體外用前炎性因子刺激膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞也能誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)，而這些因子為低分子量的蛋白質(zhì)、特異性地趨化特定的淋巴亞群到炎性區(qū)域。本研究發(fā)現(xiàn)血清中CINC水平呈短暫性增高，此結(jié)果與Yamasaki7的一致，提示這種細(xì)胞因子在趨化血液中的多形核白細(xì)胞(PMNL

16、)到腦缺血位點(diǎn)中起一定的作用。CINC同IL-8一樣，為一強(qiáng)烈的對(duì)PMNL起化學(xué)趨化作用的物質(zhì)5。在人皮下注射IL-8能誘導(dǎo)粒細(xì)胞濾出血管外并持續(xù)幾個(gè)小時(shí)。除了趨化PMNL，IL-8也能刺激粒細(xì)胞釋放顆粒和這些細(xì)胞的呼吸爆發(fā)。粒細(xì)胞釋放顆粒的同時(shí)還有補(bǔ)體和整和素含量的上調(diào)，從而進(jìn)一步促進(jìn)濾過(guò)細(xì)胞的粘附6。在腦缺血再灌注大鼠中，高濃度的IL-8相關(guān)粒細(xì)胞化學(xué)吸附劑出現(xiàn)在腦組織和血清中7。在腦內(nèi)，細(xì)胞趨化至炎性位點(diǎn)的機(jī)制沒(méi)有完全清楚。但是，在缺血腦組織局部IL-8/CINC產(chǎn)生增多可能導(dǎo)致IL-8/CINC呈濃度梯度性滲過(guò)血腦屏障，從而引起外周血IL-8濃度的升高，本研究結(jié)果也說(shuō)明了這一點(diǎn)。在化學(xué)

17、趨化過(guò)程中，細(xì)胞的遷移是沿著濃度梯度方向進(jìn)行的，最終導(dǎo)致粒細(xì)胞快速流向腦實(shí)質(zhì)，引起局部炎性反應(yīng)8。因?yàn)槟X缺血時(shí)腦內(nèi)PMNL的濾過(guò)時(shí)間延長(zhǎng)，高峰在刺激后的24到72小時(shí)，這也為開(kāi)始治療提供了足夠的時(shí)間，特別是在溶栓治療時(shí)。MPO是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞所特有的細(xì)胞內(nèi)酶，而單核細(xì)胞內(nèi)此酶的活性較低，因此以MPO活性反映組織內(nèi)中性粒細(xì)胞積聚并作為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的定量指標(biāo)是很有價(jià)值的3。Matsuo等9認(rèn)為缺血1h提供了足夠的刺激誘導(dǎo)腦缺血區(qū)血管內(nèi)中性粒細(xì)胞聚積。在實(shí)驗(yàn)中，單純?nèi)毖M各時(shí)間點(diǎn)MPO活性、CINC水平都處于較低水平且增高所需時(shí)間較長(zhǎng)，間接表明腦缺血時(shí)中性粒細(xì)胞濾出出現(xiàn)得晚且數(shù)量可能也較少。缺

18、血1h再灌注組各時(shí)間點(diǎn)MPO活性、CINC水平明顯增高而且所需時(shí)間較短。這表明隨著腦血流的再通，血管通透性增加，使得中性粒細(xì)胞濾出增多且快速，而中性粒細(xì)胞的大量活化又進(jìn)一步促使了CINC的表達(dá)。因此，本研究結(jié)果更加證實(shí)了再灌注造成的腦損傷作用比單純?nèi)毖鼑?yán)重10，但是CINC在腦缺血再灌注損傷中的地位仍有待闡明。作者單位：曹學(xué)兵（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科430022）孫圣剛（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科430022）童萼塘（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科430022）黃懷鈞（湖北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科）楊明山（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科）參考文獻(xiàn)1Watanabe K

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