川芎嗪、黃芪合用對腦缺血再灌注后腦組織c-jun蛋白表達影響

1、    川芎嗪、黃芪合用對腦缺血再灌注后 腦組織c-jun蛋白表達影響        摘要：目的：探討局灶性腦缺血再灌注后腦組織c-jun蛋白的表達及川芎嗪、黃芪對其表達的影響。方法：成年雄性SD大鼠24只隨機分成4組。A組：模型組，即腦缺血再灌注組(n=6)；B組：川芎嗪治療組(n=6)；C組：黃芪治療組(n=6)；D組：川芎嗪、黃芪合用組(n=6)。采用免疫組化與醫(yī)學像分析系統(tǒng)相結合的方法，測定4組大鼠大腦皮層c-jun蛋白陽性細胞平均灰度值。結果：4組大鼠腦組

2、織缺血側c-jun蛋白陽性細胞平均灰度均低于對側，即非缺血側(P<0.01)；在缺血側腦組織，B、C、D 3組分別與A組比較，c-jun蛋白陽性細胞平均灰度均明顯升高(P<0.01)，D組與B、C組比較，c-jun蛋白陽性細胞平均灰度明顯升高(P<0.01)。結論：局灶性腦缺血再灌注后腦組織c-jun蛋白表達顯著升高；川芎嗪、黃芪以及兩藥合用均可部分抑制c-jun蛋白表達；兩藥合用比單用川芎嗪或黃芪降低c-jun蛋白表達的作用更顯著，這可能是臨床使用益氣活血法治療缺血性腦卒中的機制之一。關鍵詞：局灶性腦缺血；缺血性腦卒中；c-jun蛋白；川芎嗪；黃芪中分類號：R743.3文獻

3、標識碼：A文章編號：1000-2219(2000)06-0057-02 研究表明，外周神經(jīng)組織和中樞神經(jīng)組織受到損傷后，神經(jīng)細胞均出現(xiàn)c-jun基因表達。c-jun基因的蛋白產(chǎn)物在遲發(fā)性神經(jīng)元壞死、神經(jīng)元可塑性、梗死灶遠隔神經(jīng)元損害、神經(jīng)元缺血耐受性影響等方面有重要意義。中醫(yī)學認為1，2，缺血性腦卒中的主要病機是氣虛血瘀，臨床多采用益氣活血法作為主要治則，療效顯著，但其作用機制尚未闡明。本研究通過觀察活血藥川芎嗪、益氣藥黃芪以及兩藥合用對局灶性腦缺血再灌注后腦組織c-jun蛋白表達的影響，探討益氣活血藥對缺血性腦卒中保護作用的機制。1材料和方法1.1材料川芎嗪注射液(麗珠集團利民制藥廠，批號9

4、90402)；黃芪注射液(上海市福達制藥有限公司，批號980601)；c-jun免疫組化試劑盒購于湖北省武漢博士德公司，抗體效價180；HPIAS1000醫(yī)學像分析系統(tǒng)，同濟醫(yī)科大學千屏影像公司生產(chǎn)；正常成年雄性SD大鼠24只，購自本校實驗動物中心，體質量350400g，隨機分為4組，每組6只。1.2方法參照Longa3報道的頸外動脈栓線法復制局灶性腦缺血再灌注模型。模型組(A)：缺血90min后拔出栓線再灌注60min；川芎嗪治療組(B)：缺血前30min腹腔注射川芎嗪33mg/kg；黃芪治療組(C)：缺血前30min腹腔注射黃芪4.5g/kg；川芎嗪、黃芪合用組(D)：缺血前30min腹腔

5、注射川芎嗪16.5mg/kg及黃芪2.25g/kg。4組大鼠均于再灌注60min時深麻醉，迅速開胸暴露心臟，經(jīng)升主動脈插管后，用40ml/L多聚甲醛(4，pH 7.4)500ml灌注固定2h。斷頭取腦，自額極至枕葉分為A、B、C、D、E 5等份，取C腦片石蠟包埋，制備4m厚的連續(xù)切片。采用ABC法進行免疫組化染色，染色步驟參照免疫組化ABC試劑盒說明書。每張切片在栓塞側及栓塞對側大腦皮層各隨機采集5個視野，輸入醫(yī)學像分析系統(tǒng)(MIPS)進行像處理，檢測陽性細胞平均灰度值。1.3統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)均以±s表示，以組間t檢驗進行統(tǒng)計學處理。2結果4組大鼠腦組織缺血側c-jun蛋白陽性細胞

6、平均灰度值均低于非缺血側(P<0.01)；在缺血側腦組織，B、C、D 3組分別與A組比較，c-jun蛋白陽性細胞平均灰度均高于A組(P<0.01)，D組與B、C組比較，c-jun蛋白陽性細胞平均灰度較B、C組明顯升高(P<0.01)。4組大鼠非缺血側c-jun蛋白陽性細胞平均灰度無顯著差異(P>0.05)。平均灰度在像分析中用來表示像的透光率，分為256級，最黑為0級，最亮為256級。c-jun蛋白陽性細胞平均灰度數(shù)值越高，說明其免疫組化染色越淺，即細胞內(nèi)c-jun蛋白含量越低。腦組織缺血再灌注后c-jun蛋白陽性細胞平均灰度值減少提示表達增強，川芎嗪、黃芪以及兩藥合用

7、使缺血再灌注后c-jun陽性細胞平均灰度值增高即表達下降，其中兩藥合用下調c-jun蛋白表達作用比單用川芎嗪或黃芪更強。見表1。表1川芎嗪、黃芪對腦缺血再灌注后c-jun蛋白表達的影響(±s)組別n缺血側灰度值非缺血側灰度值A6139.7±4.9*168.8±4.6B6156.6±3.3*171.3±5.0C6153.9±3.1*168.6±2.9D6162.3±4.0*#169.1±3.7與非缺血側比較，*P<0.01；與A組缺血側比較，P<0.01；與B、C組缺血側比較，#P<0.0

8、13討論局灶性腦缺血再灌注后腦組織c-jun蛋白表達顯著增高，表明缺血再灌注可誘發(fā)c-jun蛋白表達。c-jun基因是哺乳動物細胞內(nèi)基因的一個家庭，因其在組織癌變過程中進行表達以及它與RNA病毒轉移癌基因v-jun有相同的DNA序列，故稱之為癌基因。細胞受到創(chuàng)傷或刺激時c-jun基因是最早表達的基因之一，故又屬于立早基因。c-jun基因能被創(chuàng)傷、缺血、抽搐和感覺刺激等誘導表達。腦組織缺血再灌注損傷后，其EAA釋放急劇增多，NMDA受體被激活，使內(nèi)質網(wǎng)釋放Ca2+，活化Ca2+通道，增加細胞Ca2+內(nèi)流，從而激發(fā)了c-jun基因的表達。c-jun基因的蛋白產(chǎn)物c-jun蛋白與同時表達的FOS蛋白

9、通過亮氨酸拉鏈區(qū)結合成異構二聚體AP-1，AP-1通過與靶基因promotor區(qū)TAGC/GTCA序列結合，刺激靶基因表達。AP-1靶基因有腦啡肽前體基因、強啡肽基因、神經(jīng)營養(yǎng)因子基因、堿性成纖維細胞生長因子基因4。AP-1通過激活上述靶基因的表達，最終對刺激作出反應。本研究表明，川芎嗪、黃芪及兩藥合用組缺血側腦組織c-jun蛋白表達與缺血對側比較明顯增多，但低于模型組缺血側，表明活血類中藥川芎嗪、益氣類中藥黃芪以及兩藥合用均可部分下調腦缺血再灌注后腦組織中c-jun蛋白的表達。川芎嗪是活血化瘀類中藥川芎的主要有效成分，化學結構為四甲基吡嗪。目前已知川芎嗪具有擴張血管、抑制血小板聚集、改善微循

10、環(huán)、抗脂質氧化、增加NO等作用5，6。黃芪屬益氣類中藥，具有補氣升陽、利水消腫等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪具有抗自由基7、減少腦缺血后腦組織水腫、保護血腦屏障等作用8。由于川芎嗪及黃芪對缺血后腦組織具有多種保護作用，可緩解缺血導致的EAA釋放增多和細胞Ca2+增多，緩解缺血、缺氧所致的代謝紊亂，從而減輕了缺血導致的腦損害，使缺血誘導的c-jun蛋白高表達顯著下調。本研究發(fā)現(xiàn)活血和益氣中藥合用可顯著下調腦缺血再灌注后c-jun蛋白表達，并且其作用明顯優(yōu)于單用活血類藥物或單用益氣類藥物，證明兩類藥物有明顯協(xié)同作用。這與中醫(yī)認為缺血性腦卒中病機為氣虛血瘀的理論及中醫(yī)治療缺血性腦卒中常采用益氣活血藥

11、物配伍并用的治則相符。因此我們推測，活血化瘀配伍益氣升陽類藥物顯著下調c-jun蛋白的表達，可能是其治療缺血性腦卒中的分子機制之一。EFFECT OF LIGUSTRAZINE AND ASTRAGUS ONEXPRESSION OF c-jun IN RAT BRAINS AFTER CEREBRALISCHEMIA- REPERFUSION INJURYQU You-zhi,GAO Guo-dong,ZHAO Yan-ling(Department of Neurosurgery,Tangdu Hospital,The 4th Military Medical University,Sha

12、anxi Xian710038,China)Abstract：Objective：To investigate the expression of c-jun protein in rat brains after focal cerebral ischemia followed by reperfusion and effects of ligustrazine,astragus.Method:24 SD adult male rats were divided into 4 groups at random.Group A:model group or ischemia and reper

13、fusion group(n=6)；group B:treated with ligustrazine(n=6);group C:treated with astragus(n=6);group D:treated with ligustrazine and astragus(n=6).The immunohistochemistry and medical image processing system(MIPS) were used to measure mean grey level of c-jun positive cells in rat cerebral cortex of 4

14、groups.Result:In 4 groups,mean grey level of c-jun positive cells was lower in ischemic sides than that in non-ischemic sides(P<0.01),In ischemic sides,mean grey level of c-jun positive cellsin group B or C or D was higher than that in group A(P<0.01)，mean grey level of c-jun positive cells in

15、 group D was higher than that in group B or group C(P<0.01).Conclusion:Expression of c-jun protein increased significantly after cerebral ischemia and reperfusion.Ligustrazine,astragus,ligustrazine and astragus all could inhibit partly the expression of c-jun protein.Prescription of ligustrazine

16、and astragus has stronger inhibiting actions than ligustrazine or astragus.It may be one of mechanisms that ischemia stroke is treated by reinforcing Qi and activating blood circulation therapy in TCM clinics.Key words：Focal cerebral ischemia;Ischemic stroke;c-jun;Ligustrazine;Astragus作者簡介：曲友直(1973-

17、)，男，醫(yī)師，醫(yī)學碩士。參考文獻1王玉升，王軍.中藥治療腦缺血實驗研究概況J.中醫(yī)研究，1997，10(4)：52.2郭改會，董鴻瑞，傅仁杰.益氣活血化瘀法治療缺血性中風研究近況J.中國中醫(yī)藥信息雜志，1997，4(8)：11.3Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in ratsJ.Stroke,1989,20:84.4Lun HM,Chen HH.c-fos protein expression and ischemic change in neurons vulnurable to ischemia/hypoxia,correlated with basic fibroblast growth factor immunoreactivityJ.J Neu