熊果酸和齊墩果酸對胰脂肪酶活性及構(gòu)象的影響

1、熊果酸和齊墩果酸對胰脂肪酶活性及構(gòu)象的影響                       作者：劉志芳，田萌，馬躍文，李政，李黎，劉克武【摘要】  目的研究熊果酸（UA）和齊墩果酸（OA）對胰脂肪酶（LPS）活性和構(gòu)象的影響。方法采用紫外光譜法、熒光光譜法以及圓二色譜法分析UA和OA作用后LPS相應(yīng)圖譜的特征。結(jié)果UA和OA作用后LPS的活性明顯降低，紫外吸收光譜發(fā)生改

2、變。熒光淬滅結(jié)果顯示UA作用后，LPS的熒光發(fā)生淬滅，且淬滅的機制為靜態(tài)淬滅和動態(tài)淬滅組合的淬滅機制，而OA對LPS熒光淬滅主要為靜態(tài)淬滅；UA和OA作用后LPS的圓而色譜圖譜發(fā)生改變。結(jié)論UA和OA都可以抑制LPS的活性、影響LPS的構(gòu)象，且UA對LPS的構(gòu)象影響及抑制作用更加顯著。 【關(guān)鍵詞】  熊果酸 齊墩果酸 胰脂肪酶 紫外光譜 熒光光譜 圓二色譜脂肪酶(lipase，簡稱 LPS) 是一種特殊的酯鍵水解酶，廣泛存在于動物組織、植物種子和微生物體中，它能催化天然底物油脂水解，產(chǎn)生脂肪酸和甘油 1。    熊果酸(ursolic acid, UA

3、) 和齊墩果酸(oleanolic acid, OA )為同分異構(gòu)體,均屬于五環(huán)三萜類化合物,廣泛存在于中草藥中,且具有多種生物活性2。OA和UA都具有一定的降脂作用，能夠有效地降低高脂血癥小鼠的血脂3，4，有望開發(fā)成新型降脂藥。但OA和UA降脂作用的強弱的比較及降脂作用機理尚未見報道。本文采用紫外光譜、熒光光譜和圓二色譜等方法，研究了UA和OA對LPS活性及構(gòu)象的影響，比較了UA和OA對LPS抑制作用的強弱，為探尋OA和UA降脂作用機理，將其開發(fā)為一種雙成分降脂新藥提供理論。1  儀器與試劑    F-4500熒光光譜儀(日立)，TU-1800紫外可見

4、分光光度計（北京普析通用儀器公司），JASCO-J-810圓二色譜儀(日本JASCO公司)。齊墩果酸和熊果酸購自陜西森弗生物技術(shù)有限公司，胰脂肪酶購自Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。2  方法2.1  UA，OA對LPS活性的影響在酶的反應(yīng)體系中分別加入不同濃度的UA和OA，改變底物橄欖油的濃度，測定酶促反應(yīng)的初速度。以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，并抑制速度常數(shù)。2.2  UA，OA對LPS構(gòu)象的影響取2 ml濃度為1×10-5 mol/L的LPS溶液，分別加入不同微量體積的UA和OA（1.0×10-3 mol/L）溶液

5、，使三萜類小分子與LPS的終摩爾比分別為01，0.21，0.41，0.61，0.81，11，31，51?；旌暇鶆蚝?，室溫放置10 min，以相同濃度的小分子溶液作空白，記錄 200300 nm的紫外吸收光譜。    以295nm為激發(fā)波長，室溫下測定300400 nm的熒光光譜，溶液濃度及反應(yīng)條件同上述。樣品池光程為0.1 cm ,在室溫下測定波長范圍190250 nm的CD譜。CD譜用平均殘基摩爾橢圓度表示，單位為deg ·cm2 ·mol -1 ，數(shù)據(jù)經(jīng)3次掃描取平均值。得出CD譜后, 用該儀器附帶的楊氏方法軟件計算脂肪酶的二級結(jié)構(gòu)含量。L

6、PS濃度為1 ×10-5 mol/L，實驗時三萜類小分子與LPS的終摩爾比為01，0.41，31。3  結(jié)果與討論3.1  UA，OA對LPS活性的影響不同濃度的UA，OA對LPS活力的影響結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，UA，OA對LPS都有一定的抑制作用，抑制作用隨UA，OA濃度的升高而增強。在相同濃度下，UA的抑制作用大于OA。3.2  UA，OA對LPS的抑制動力學(xué)UA，OA對LPS的抑制作用如圖2。由圖可知隨著UA，OA濃度的升高，酶的Km值保持不變，而Vmax則隨UA，OA濃度的升高而不斷降低。因此UA、OA對LPS均屬于非競爭性抑制。 

7、;   采用Dixon作圖法，以1/V對不同濃度的UA，OA作圖，可得到UA，OA的抑制常數(shù)Ki。UA，OA的Ki分別為0.6 mmol/L，0.46 mmol/L，可見抑制作用UA大于OA。3.3  不同濃度UA，OA對LPS的紫外吸收差譜大多數(shù)蛋白質(zhì)分子在280 nm附近有一個吸收峰，是由于色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)等芳雜環(huán)對光的吸收；同時在220 nm左右有一個由肽鍵的C=O的-躍遷引起的強吸收峰，與蛋白質(zhì)的-螺旋含量有關(guān)7。    用不同濃度的UA，OA作用于LPS的紫外吸收差譜如圖3?？芍狶PS在270 nm和220

8、 nm附近出現(xiàn)最大吸收峰，且隨UA、OA濃度的增加LPS在220 nm 和270 nm附近的吸收不斷增大，圖3A中最大吸收都有少許紅移。在低濃度時，酶在220 nm 和270 nm附近的吸收隨濃度的增加而急劇增加，當(dāng)UA與酶的比例達(dá)到1/1后，紫外吸收增幅減慢。因此可以認(rèn)為UA與LPS的摩爾比例為1/1時，具有最大紫外吸收。圖3B中OA作用后的LPS最大吸收峰發(fā)生紅移，當(dāng)OA與酶的比例達(dá)到3/1后，紫外吸收增幅明顯減慢。因此可以認(rèn)為OA與LPS的摩爾比例為3/1時，具有最大紫外吸收。    從由不同濃度的UA、OA作用后LPS的紫外吸收差譜可見，LPS270nm和

9、280nm附近的吸收主要是由于肽鍵C=O基的-躍遷所引起，與蛋白質(zhì)的-螺旋含量有關(guān)6。當(dāng)UA、OA濃度較低時，這些小分子與LPS的結(jié)合有利于酶分子間和分子內(nèi)的團聚作用，使包圍在LPS分子內(nèi)部的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環(huán)疏水基團裸露出來,改變了芳香族氨基酸殘基在空間結(jié)構(gòu)中所處的微環(huán)境使蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生改變，螺旋含量減少；當(dāng)小分子濃度進(jìn)一步升高時，UA處理后的LPS分子發(fā)生蛋白質(zhì)肽鏈伸展現(xiàn)象，使酶分子中疏水作用略有增強，吸收峰略增加且略有紅移7，因此在紫外差譜中酶的最大吸收增加明顯減緩，并產(chǎn)生紅移。而OA沒有紅移現(xiàn)象，表明UA與酶的結(jié)合對酶構(gòu)象的影響較OA大。1   

10、60;     3.4  不同濃度UA，OA對LPS的熒光光譜的影響蛋白質(zhì)中芳香氨基酸的熒光特性可用來推測蛋白質(zhì)的溶液構(gòu)象，提供有關(guān)蛋白質(zhì)生色基團的結(jié)構(gòu)及所處微觀環(huán)境的信息。蛋白質(zhì)分子中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)具有熒光性質(zhì)，此蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光可作為探針檢測蛋白質(zhì)構(gòu)象變化。295 nm波長光激發(fā)時，蛋白質(zhì)分子中的Trp殘基受到激發(fā)，所產(chǎn)生熒光的強度和位置與這些殘基所處的微環(huán)境密切相關(guān)8。    由圖4可知，295 nm激發(fā)時熒光光譜的最大發(fā)射波長是340 nm，隨著UA、OA濃度

11、的不斷增加，熒光強度明顯減弱, 出現(xiàn)典型的熒光猝滅現(xiàn)象，表明其與酶結(jié)合后引起蛋白質(zhì)的構(gòu)象變得疏松，局部構(gòu)象發(fā)生變化，變化后的結(jié)構(gòu)不利于酶的催化，故酶活力逐漸降低9。而在圖4A中，隨著UA濃度的增加，發(fā)射峰位紅移，說明LPS中發(fā)生熒光淬滅的Trp和Tyr殘基周圍的疏水性有所增加。同時出現(xiàn)了裂峰，原來341 nm處的單峰逐漸裂分為二重峰，其中一峰峰值藍(lán)移至325 nm，另一峰峰值紅移至360 nm。藍(lán)移峰最可能是LPS中Tyr殘基受UA誘導(dǎo)而終止與Trp殘基間的共振能量轉(zhuǎn)移，分裂出自身的熒光發(fā)射峰；紅移峰應(yīng)歸屬于Trp殘基10，11,表明原來疏水環(huán)境的Trp殘基逐漸暴露在極性環(huán)境中，使蛋白質(zhì)的構(gòu)象

12、變得疏松，酶催化活力降低 10。3.5   UA，OA對LPS熒光淬滅的機理若將UA，OA對LPS熒光的淬滅歸因于分子碰撞引起的動態(tài)淬滅, 按照Stern - Volmer方程12：    F0/F1Kq0 Q1KsvQ             （1）    式中：F0為無淬滅劑時LPS的熒光強度，F(xiàn)為有淬滅劑時LPS的熒光強度，Kq為分子淬滅速率常數(shù)，0為淬滅劑不存在時物質(zhì)的熒光壽命，Ksv為動

13、態(tài)淬滅常數(shù)，Q為淬滅劑濃度。當(dāng)溫度為20 時，求出Ksv（UA）=17.19×104  (mol·L)-1（圖5）Ksv（OA）= 10.62 ×104  (mol·L)-1。生物大分子的熒光平均壽命約為10-8 s，因而可以求得Kq（UA）=17.19×1012  (mol·L)-1s-1 。Kq（OA）= 10.62 ×1012  (mol·L)-1s-1   37 時，求出Kq（UA）=17.02×1012  (mol·

14、L)-1s-1  Kq（OA）=10.35×1012  (mol·L)-1s-1 。遠(yuǎn)大于各類淬滅劑對生物大分子的最大擴散常數(shù)2.0×1010  (mol·L)-1s-1，表明UA、OA對LPS的熒光淬滅并不是由于分子擴散和動態(tài)碰撞引起的動態(tài)淬滅，而可能是靜態(tài)淬滅。但從圖5可以看出當(dāng)Q1.0×10-5 mol·L-1時，UA的Stern-Volmer曲線開始偏向Y軸，說明存在一定的動態(tài)淬滅效應(yīng)。因此當(dāng)淬滅劑UA濃度較低時以靜態(tài)淬滅為主, 隨著淬滅劑濃度增大, 動態(tài)淬滅逐漸體現(xiàn)。因此，靜態(tài)淬滅和動態(tài)淬滅是導(dǎo)

15、致UA對LPS熒光淬滅的兩大原因，而OA對LPS熒光淬滅主要歸因于靜態(tài)淬滅。3.6   結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)的設(shè)UA、OA與LPS之間形成n個結(jié)合位點的復(fù)合物, 則結(jié)合常數(shù)Ka和n值可從式(2)計算得到13    lg(F0-F)/F=lgKA+nlgQ(2)    不同溫度下求得的KA值和n值列于表1，從表1可以看出，UA、OA與LPS之間都只有一個結(jié)合位點，具有強的相互作用。隨著溫度升高,產(chǎn)物的穩(wěn)定性降低,靜態(tài)淬滅常數(shù)KA減小，進(jìn)一步推斷淬滅過程為形成化合物所引起的靜態(tài)淬滅。表1  不同溫度下藥物與L

16、PS結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點數(shù)（略）3.7  不同濃度UA、OA作用后LPS的圓二色譜蛋白質(zhì)的CD光譜178250 nm為遠(yuǎn)紫外區(qū)CD光譜,可以反映肽鍵的圓二色性。在蛋白質(zhì)或多肽的規(guī)則二級結(jié)構(gòu)中,肽鍵是高度有排列的, 排列的方向性決定了肽鍵能級躍遷的分裂情況。因此具有不同二級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或多肽所產(chǎn)生CD譜帶的位置、吸收的強弱都不相同14。    圖6為不同三萜類藥物濃度下LPS溶液的CD光譜。其中1曲線(LPS空白)顯示了典型LPS的結(jié)構(gòu),分別在206 nm和220 nm處出現(xiàn)負(fù)峰,在191 nm處出現(xiàn)正峰,隨著藥物的加入, LPS的CD光譜的負(fù)峰強度逐漸降低,且計算得到在UA，OA最大濃度作用下螺旋含量分別減少了3.51%和2.86%，說明藥物分子與LPS結(jié)合后引起其微構(gòu)像的變化,使LPS肽鏈伸展,改變了LPS的二級結(jié)構(gòu),導(dǎo)致螺旋結(jié)構(gòu)的減少14，15。從圖6和螺旋含量變化可以得出相同濃度下UA比OA對酶二級結(jié)構(gòu)影響更加顯著，在紫外光譜和熒光光譜基礎(chǔ)上證實了UA對LPS構(gòu)象的影響比OA顯著。    以上實驗結(jié)