時間分辨熒光法高通量篩選魚肉組織中土霉素的殘留量

1、時間分辨熒光法高通量篩選魚肉組織中土霉素的殘留量 【摘要】 目的 動物組織中抗生素殘留量的測定一般需要多步驟的樣品處理過程。本文介紹了一種全新的、簡便和快速篩選魚肉中土霉素殘留量的方法。采用固相萃取和時間分辨熒光(time resolved luminescence，TRL)技術，無須離心和過濾，簡化了分析過程。方法 將C18小片浸在組織勻漿液中提取和富集20min，取出，在水中浸泡3min，接著浸在TRL試劑溶液中2min，最后取出干燥。干燥后，在C18小片表面上直接進行熒光測定。結果 土霉素在08g/g的范圍內(nèi)，儀器信號的響應與濃度呈現(xiàn)良好的線性關系(2=0.9992)，檢測限為0.026

2、g/g，采用本法對45個加標準液的樣品(濃度范圍在04g/g)進行分析，其中41個樣品的定性結果正確，只有4個樣品定性結果顯假陽性。結論 本方法簡便，快速，準確，適用于魚肉組織中土霉素的高通量篩選分析。 【關鍵詞】 時間分辨熒光； 篩選； 抗生素； 土霉素 ABSTRACT Objective Analysis of antibiotics in animal tissue matrices require multistep sample preparation. A new, easy and rapid method screening the oxytetracycline (OTC)

3、 in catfish is developed. It combines sorbent extraction and solidmatrix timeresolved luminescence (TRL) procedures. Without centrifugation and filtration, the analysis process get more easy and rapid. Method Extraction and enrichment are accomplished by immersing small C18 strips into tissues homog

4、enates for 20 min, followed by a 3 min rinse in water and 2 min dip in a reagent solution. After desiccation, TRL is measured directly on the C18 surface. Result The integrated TRL intensity shows a linear dependence on OTC concentration in the 08g/g range (2=0.9992) with a 0.026g/g limit of detecti

5、on. Among 45 blind samples randomly fortified at 04g/g, 41 were screened correctly and 4 negative samples were presumed positive only. Conclusion The method is simple, rapid and accurate and can be used for high throughout screening of OTC in tissue matrices. KEY WORDS Timeresolved luminescence; Scr

6、eening; Antibiotics; Oxytetracycline 土霉素(OTC)是水產(chǎn)養(yǎng)殖中治療活性氣單胞菌屬敗血癥及假單胞菌屬敗血癥的三種常用抗菌藥物之一1，過度使用可引起土霉素在魚體中的蓄積并導致細菌的耐藥性。美國FDA規(guī)定用藥后經(jīng)過21d的消除期后最大殘留限度為2ppm。目前，定量測定魚肉中土霉素應用最多的是高效液相色譜方法， 通過紫外檢測2、熒光檢測3或質(zhì)譜檢測4進行測定。上述檢測方法樣品處理步驟繁鎖(如勻漿，離心，過濾及固相萃取和凈化等)，實驗時間長，工作量大，難以用于大批量樣品的檢驗。本文介紹的方法無須離心和過濾，大大簡化了樣品處理過程，可對大量樣品首先進行篩選分析，再對

7、疑似陽性的樣品再進行定量分析。 1 儀器和試藥 熒光檢測儀(瓦里安，Walnut Creek，CA)型號：Cary Eclipse；數(shù)據(jù)采集及處理軟件為Cary Eclipse Lifetime software；試劑及試藥均為分析級，購自Aldrich(Milwaukee，WI)；去離子水處理系統(tǒng)為Barnstead Epure system (Dubuque，IA)；勻漿機為UltraTurrax，Janke and Kunkel，Cincinnati，OH)；C18薄層板(200mm50mm)：購自于Analtech(Newark，DE)，再將其分割為10mm25mm的小片，然后除保留小

8、片中間6mm10mm的區(qū)域外，其余部分用刀片刮盡，處理后置于干燥箱中備用。土霉素儲備液(1mg/ml于甲醇中，冰箱4保存)，臨用前稀釋；TRL試劑為0.5mmol/L Eu(NO3)33.0mmol/L Na2EDTA2.5%(w/v)氯化十六烷基三甲基銨(CTAC)的0.15mol/L的tris緩沖液(pH8.5)。 2 實驗步驟 2.1 提取和富集 取魚肉(3.00.02)g置50ml聚丙烯離心管中，加入一定量的土霉素標準溶液至一定的濃度(如2ppm)，暗處放置10min，加入7ml的0.01mol/L Na2EDTA溶液后勻漿，再加入0.5ml的20%(w/v)氯化鈉溶液，渦旋混勻。從干

9、燥器中取出C18小板，先用少量甲醇潤濕其表面，再用清水淋洗，在表面未干之前將其置于勻漿液中，20min后取出，浸沒于清水中3min，取出。用紙在板的下邊緣處吸去水滴。 2.2 測定 將上述C18小板浸入11ml的TRL試劑中，維持2min。取出后用紙在板的下邊緣處吸去水滴，將C18小板置于密閉的干燥器內(nèi)干燥約30min，直至觀察到C18小板表面的顏色由暗轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟咨?，最后把C18小板固定到樣品支架上進行測定。激發(fā)和發(fā)射波長分別為388和615nm，延遲時間設定為10s，對0.11.0ms之間的信號進行面積積分。 3 結果和討論 3.1 時間分辨熒光 土霉素結構本身具有熒光性質(zhì)，并且在與瀾系金屬

10、Eu(III)形成復合物后能夠進行復合物內(nèi)的能量傳遞。能量從激發(fā)態(tài)的土霉素傳遞到發(fā)射態(tài)的Eu3+。從圖1中看出，土霉素受激發(fā)后在388nm處有一個較寬的分子吸收峰，能量傳遞后，Eu3+在615nm處產(chǎn)生尖峰。能量傳遞的結果使得產(chǎn)生較大的Stokes位移(約230nm)，提高了儀器檢測的靈敏度，更重要的是產(chǎn)生了較長的熒光持續(xù)時間(約1ms，圖2)。利用時間分辨的特性，在除去可能引起干擾的熒光信號(約數(shù)ns的范圍)后，對范圍在0.11.0ms之間的信號進行面積積分后，對土霉素的濃度進行定性分析。我們考察了不同濃度的土霉素與Eu3+結合后產(chǎn)生的信號強度，結果表明，土霉素濃度在08g/g的范圍內(nèi)，儀器

11、信號的響應與濃度呈現(xiàn)良好的線性關系(2=0.9992，圖3)。 3.2 固相萃取劑及萃取時間的選擇 C18對非極性物質(zhì)具有較強的吸附性，實驗5證明它可以作為一種較好的吸附劑用于吸附土霉素，并可以直接在它的表面上進行熒光測定。需注意的是在試驗中切割薄層板的時候手指盡量不要接觸到C18的表面，同時用力應均勻，否則會對實驗結果產(chǎn)生較大的影響。我們考察了C18小板在組織液中放置不同時間后的熒光信號(圖4，每個濃度點3份平行樣測定，圖中以均值SD表示)。 圖中雖然在40min時熒光響應最大，但考慮到現(xiàn)場測定要求時間短，同時實驗觀察到20min時熒光的信號已經(jīng)足夠大并且有較好的重復性，綜合以上因素考慮，萃

12、取時間選擇了20min。 3.3 檢測限 根據(jù)國際理論與應用化學家(IUPAC)規(guī)定，熒光法檢測限的計算按照L=Ks/b計算，式中L：檢測限；s：n次空白樣品測得值的標準偏差(本實驗n=15)；K：置信系數(shù)，一般為3；b：標準曲線回歸方程中的斜率。 根據(jù)3.4中的實驗數(shù)據(jù)， 計算得到檢測限為0.026g/g。 3.4 定性閾值的建立及盲樣的測定 閾值的建立對測定結果的判斷很重要。閾值如果設定過高，容易產(chǎn)生假陰性；反之，則有較多的疑似陽性的結果。作者對15個空白樣品和15個加標樣品(濃度為2.0g/g)進行了分析，結果見圖5，圖中x和分別代表空白樣品和加標樣品測定信號積分值的平均值和標準偏差。根

13、據(jù)統(tǒng)計分析中隨機數(shù)據(jù)正態(tài)分布的規(guī)律，數(shù)據(jù)落在(x)、(x2)和x3范圍外的幾率分別為15.87%、2.27%和0.13%，本實驗選取x232作為閾值。為了考察閾值的設定是否合理，我們配制了45個盲樣(濃度范圍在04g/g)，測定結果見表1。所有21個陽性樣品(指添加標準濃度大于/等于2g/g)全部檢出，在24個陰性樣品(指添加標準濃度小于2g/g)中有4個樣品檢出結果為疑似陽性，數(shù)據(jù)分析這4個樣品的加標樣后濃度均接近了2.0g/g(4個樣品的加標濃度在1.911.97g/g之間)。由此得出，本方法具有很大的實際應用價值。 3.5 展望 盡管本方法作為一種高通量的定性篩選方法，但根據(jù)在08g/g

14、的范圍內(nèi)，儀器信號的響應與濃度呈現(xiàn)良好的線性關系，檢測限為0.026g/g，并且加標盲樣的測試結果較為滿意，是否可以直接用做定量測定將進一步考察。 4 小結 本方法采用組織液中直接萃取的提取方法，吸收了固相萃取的優(yōu)點，同時避免了目前常規(guī)檢驗方法中離心和過濾等步驟，并且不使用有機溶劑，降低了對實驗人員及環(huán)境的危害。通過專屬性極強的OTCEu3+復合物內(nèi)能量傳遞所具有的時間分辨技術與固相萃取技術的聯(lián)用，快速的對魚肉組織體內(nèi)的OTC進行篩選，配合便攜式熒光測定儀更可進行現(xiàn)場測定。【參考文獻】 1 Plumb A J. Talapia bacterial diseases in health main

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