野生稻高產(chǎn)基因及其分子標記輔助育種研究

1、野生稻高產(chǎn)基因及其分子標記輔助育種研究鄧啟云1, 袁隆平1, 梁鳳山2, 李繼明1, 李新奇1, 王樂光2, 王 斌2( 1 國家雜交水稻工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410125；2 中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所, 北京 100101）摘要：傳統(tǒng)遺傳育種方法在挖掘和利用水稻栽培品種的遺傳資源方面日趨飽和，進一步提高雜交水稻產(chǎn)量潛力必須考慮利用水稻野生近緣種的有利基因庫。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，分子標記輔助選擇在定向?qū)脒h緣有利基因方面的研究日益成為活躍的研究領(lǐng)域。介紹了馬來西亞普通野生稻的2個高產(chǎn)QTLs的發(fā)現(xiàn)，及其分子標記輔助育種的初步進展，并展望了這一領(lǐng)域的研究前景。關(guān)鍵詞：野生稻高

2、產(chǎn)基因（QTL）；雜交水稻；分子標記輔助選擇（MAS）中圖分類號: 文獻標識碼: A.文章編號：Studies on Yield-enhancing Genes from Wild Rice and Its Marker-assisted Selection in Hybrid RiceDENG Qi-yun1, YUAN Long-ping1, LIANG Feng-shan2, LI Ji-ming1, LI Xin-qi1, WANG Yue-guang2, WANG Bin2( 1 China National Hybrid Rice Research and Development

3、Center (CNHRRDC), Changsha, Hunan 410125, Peoples Republic of China; 2 Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, Peoples Republic of China )Abstract: Facts have proved that genetic improvements are the most practicable way to increase rice producti

4、vity. But it is now quite limited to further raise the rice ceiling through traditional breeding methods based on the exploitation of genetic diversities within Oryza sativa. As the biotechnology fast developing recently, it becomes more and more important research field that breeders try to introdu

5、ce distantly related favorable genes into rice cultivars from wild relatives of rice. It is described here that the discovery of the two yield-enhancing QTLs from wild rice and preliminary studies on marker assisted selection (MAS) in hybrid rice breeding program. And the prospects in the realm of M

6、AS breeding were also discussed in the paper.Keywords: Yield-enhancing genes (QTLs) from wild rice; Hybrid rice; Marker-assisted selection (MAS)我國現(xiàn)有人口超過13億，人均耕地面積不足867 m2, 預(yù)計本世紀30年代，我國人口將增加到16億，人均耕地將減少到667 m2左右，糧食自給仍然是擺在我們面前的緊迫問題。從全球范圍看，由于人口增長以及環(huán)境惡化和城市化發(fā)展所帶來的耕地面積減少的趨勢在相當長一段時間內(nèi)還無法逆轉(zhuǎn)，因此繼續(xù)提高主要糧食作物單位面積產(chǎn)

7、量始終是各國政府和科學家關(guān)注的熱點課題。水稻是最重要的糧食作物之一，實踐證明，通過遺傳改良來提高水稻單位面積產(chǎn)量是最行之有效的途徑。1 水稻產(chǎn)量性狀遺傳改良的現(xiàn)狀和挑戰(zhàn)近三十年來我國常規(guī)水稻育種在發(fā)掘產(chǎn)量潛力方面基本處于徘徊狀態(tài)，目前大面積推廣的常規(guī)早稻新品種，其產(chǎn)量潛力基本和60年代選育的廣陸矮4號相同。三系法雜交水稻的培育成功帶來了一次水稻單產(chǎn)的飛躍，為解決我國糧食問題做出了巨大貢獻。但近年來，由于受現(xiàn)有親本遺傳基礎(chǔ)的限制，單產(chǎn)也出現(xiàn)了徘徊局面。在超級雜交水稻理論提出后，在充分利用水稻形態(tài)改良成就和亞種間雜種優(yōu)勢相結(jié)合的基礎(chǔ)上，水稻產(chǎn)量又獲得了顯著提高。但是，由于水稻栽培種遺傳資源的利用已

8、日趨飽和，并且許多改良品種具有相同或相似的遺傳來源，容易造成遺傳上的單一性，因此，在現(xiàn)有高產(chǎn)或超高產(chǎn)的前提下，欲進一步提高水稻產(chǎn)量潛力，必須尋求新途徑，創(chuàng)制和利用具有豐富變異的新材料，這將是未來水稻產(chǎn)量潛力獲得進一步突破的方向。進一步擴大親本間的遺傳差異，可以考慮從遠緣種群中引入高產(chǎn)基因資源。栽培水稻有20多個野生近緣種，包含有極其豐富的遺傳變異。為了拓寬栽培品種的遺傳多樣性，許多育種家都試圖發(fā)掘這一重要的遺傳資源寶庫，并為此做出了不懈的努力，在質(zhì)量性狀方面已經(jīng)取得了顯著成效。如60年代發(fā)掘和利用來源于O. nivana的水稻草叢矮縮病持久抗性12；70年代，我國科學家又從O. rufipog

9、on中找到雄性不育細胞質(zhì)基因，實現(xiàn)了雜交水稻的三系配套34；近年來人們又在長藥野生稻中發(fā)現(xiàn)了高抗白葉枯病基因Xa-21，并將其轉(zhuǎn)移到栽培稻中。但產(chǎn)量屬于數(shù)量性狀，由多基因控制，直接利用野生資源中的某一特定基因來改良水稻產(chǎn)量等數(shù)量性狀，目前尚無先例。究其原因主要存在兩大障礙：一是野生稻中存在大量對產(chǎn)量不利的性狀干擾，使高產(chǎn)基因型的鑒定十分困難；二是連鎖累贅，即目的基因與不利基因的緊密連鎖是常規(guī)的遠緣雜交育種中難以克服的難題。因此，要發(fā)掘和利用野生稻有利基因以用于改良栽培水稻產(chǎn)量潛力，必須開拓相應(yīng)有效的新技術(shù)。2 分子標記的發(fā)展與應(yīng)用近20 a年來迅速發(fā)展的基于DNA的分子生物學技術(shù)，如分子標記和

10、作圖技術(shù)，不僅使鑒定數(shù)量性狀基因位點成為可能，同時給育種提供了嶄新的途徑，這就是所謂的“分子標記輔助選擇”（marker-assisted selection，MAS）。分子標記基于DNA分子變異，與形態(tài)學標記和同工酶標記相比，具有下列優(yōu)點：(1) 基因組DNA的變異十分豐富，因此分子標記的數(shù)量幾乎是無限的；(2) 多數(shù)分子標記(如RFLP，SCAR，SSR)都是共顯性標記，對選擇隱性基因控制的農(nóng)藝性狀十分有利；(3) 不同發(fā)育階段、不同組織的DNA均可用于標記分析，使對作物基因型的早期選擇成為可能；(4) 分子標記直接揭示來自DNA的變異，使育種家有可能依據(jù)植株基因型而不只是表現(xiàn)型來選擇優(yōu)良

11、性狀。隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展，分子標記輔助選擇和聚合育種技術(shù)亦得到迅速發(fā)展，大大提高了育種效率，加速了育種進程。Sheng Chen等通過分子標記輔助選擇方法對雜交水稻恢復(fù)系明恢63進行改良，將Xa-21基因轉(zhuǎn)移到明恢63，獲得了抗白葉枯病的明恢63，從而達到對雜交水稻汕優(yōu)63進行遺傳改良的目的5。黃寧等利用分子標記輔助選擇將白葉枯病抗性基因Xa-4, Xa-5, Xa-13 和Xa-21 聚合到同一水稻品種中，大大提高了其對白葉枯病的抗性6。在番茄的果重和可溶性固相物含量的改良方面，應(yīng)用RFLP圖譜技術(shù)定向轉(zhuǎn)移微效數(shù)量性狀基因已經(jīng)獲得成功。在已構(gòu)建的RFLP圖譜中定位了6個控制果重的QTL，

12、每一位點的作用幅度為3.56.0 g。還定位了4個控制可溶性固相物含量的QTL，每個位點的作用幅度為0.83%1.89%7。采用分子標記輔助選擇技術(shù)，已成功地將這些有用的QTLs轉(zhuǎn)移到商用番茄雜交種的染色體中，使產(chǎn)量增加20%以上。3 野生稻高產(chǎn)基因的發(fā)掘為從野生稻中發(fā)掘和利用有利基因以進一步提高雜交水稻產(chǎn)量潛力，自1992年以來，國家雜交水稻工程技術(shù)研究中心與美國康奈爾大學合作，著手從分子水平進行研究，從馬來西亞普通野生稻（O. rufipogon）中發(fā)掘高產(chǎn)基因資源。用普通野生稻與栽培稻V20A不育系雜交，再用V20B連續(xù)回交兩代，從BC2的3000株中選300株與測64-7測交配制成30

13、0個組合，每個組合含1.5%11.5%不等(平均為4.5%)的野生稻遺傳信息。考種結(jié)果表明，大多數(shù)組合中含有的野生稻等位基因?qū)Ξa(chǎn)量沒有增產(chǎn)效果或相對于栽培種中的等位基因是有害的影響。但來自野生稻1號染色體上RM5標記位點處以及2號染色體上RG256附近的2個QTLs卻能明顯地使產(chǎn)量增加，分別具有18%和17%的增產(chǎn)效應(yīng)。同時，這些組合在千粒重、株高和生育期上與對照沒有明顯區(qū)別。1995年從300個BC2測交群體（V20A/馬來西亞普通野生稻/V20B/V20B×測64-7）中發(fā)現(xiàn)有7個品系比對照（威優(yōu)64）增產(chǎn)30%以上。經(jīng)進一步分析，發(fā)現(xiàn)分別位于1號和2號染色體上的兩個正向QTL位

14、點（即yld1.1和yld2.1），每一個具有在現(xiàn)有三系雜交稻基礎(chǔ)上增產(chǎn)約18%的效應(yīng)89。這一發(fā)現(xiàn)后來從其他一些野生稻產(chǎn)量QTL分析群體得到進一步證實，如國際熱帶農(nóng)業(yè)研究中心（CIAT）的巴西粳稻群體10等，其高產(chǎn)基因也定位在第1染色體上與yld1.1相近的位置。2002年，我國學者李德軍等以江西東鄉(xiāng)普通野生稻為供體親本, 在桂朝2號的遺傳背景下，在第2和11號染色體上也發(fā)現(xiàn)了來自東鄉(xiāng)野生稻的2個高產(chǎn)QTL，分別能使桂朝2號單株產(chǎn)量增加25.9%和23.2%11。由此可見，普通野生稻（O. rufipogon）是一個重要的有利基因庫，其中存在高產(chǎn)QTLs的事實已毋庸置疑，而且借助于分子標記等

15、技術(shù)最終可能通過育種程序?qū)⑦@些QTLs集中起來加以利用，以提高水稻產(chǎn)量潛力。4 分子標記輔助育種策略應(yīng)用分子標記輔助選擇利用遠緣有利基因的策略主要有回交轉(zhuǎn)移、雜交轉(zhuǎn)移、輪回選擇和基因累加等方法，其中應(yīng)用較多的是回交轉(zhuǎn)移和雜交轉(zhuǎn)移的方法。4.1 回交轉(zhuǎn)移在利用分子標記輔助選擇進行外源基因的轉(zhuǎn)移時，必須保證目標基因位于足夠大的染色體片斷之內(nèi)，同時又不能使這個片斷太大，因為片斷太大會使與目標基因連鎖的非期望基因或不利基因也轉(zhuǎn)移到受體親本中，即帶來連鎖累贅(linkage drag)。以普通野生稻為高產(chǎn)基因供體，以生產(chǎn)上大面積應(yīng)用的優(yōu)良恢復(fù)系為高產(chǎn)基因受體和輪回親本，進行雜交和連續(xù)回交，使分子育種建立

16、在一個產(chǎn)量水平較高的平臺上，有利于充分發(fā)揮高產(chǎn)基因的增產(chǎn)效果。通過回交并對每個回交世代進行分子標記輔助選擇，逐步建立起野生稻高產(chǎn)基因近等基因系，對中選的優(yōu)良恢復(fù)系材料進行測交鑒定，最后根據(jù)大量測交F1的產(chǎn)量表現(xiàn)再決選恢復(fù)系株系。配制的雜交組合還同時進行生產(chǎn)試驗和大面積示范以確認其實際增產(chǎn)效果。采用這種分子標記分析與田間選擇、雜種鑒定相結(jié)合的方法，可以避免由于交換造成的含野生稻高產(chǎn)基因的DNA片段丟失。傳統(tǒng)的回交轉(zhuǎn)移方法最大的缺陷是多代回交后還存在著大量的來自供體親本的非期望基因。利用分子標記輔助選擇可直接選擇在目的基因附近發(fā)生重組的個體，從而可望在很大程度上解決連鎖累贅的問題，同時可以減少回交

17、代數(shù)1213。理論上，可能在回交一代就有一些個體的一些染色體是純合的而目標基因是雜合的，選擇它們進行回交將大大縮短育種進程，但這需要以前景選擇（foreground selection）和背景選擇（background selection）為前提1416。比較好的辦法就是多進行兩輪回交選擇，即大大降低分子鑒定的費用。在西紅柿上利用分子標記輔助回交育種方面的工作十分出色, 野生種的不少有益基因成功地轉(zhuǎn)移到了栽培品種中1720。4.2 雜交轉(zhuǎn)移雜交育種是雜交水稻親本選育中一種普遍使用的育種方法。就前述野生稻高產(chǎn)基因yld1.1和yld2.1而言，由于它們是兩個控制產(chǎn)量性狀的主效QTL，每個QTL對

18、產(chǎn)量的貢獻值都非常顯著，因此也適合采用分子標記輔助的雜交育種策略將高產(chǎn)基因進行親本間轉(zhuǎn)移。近年來，以初步育成的攜帶野生稻高產(chǎn)基因的強優(yōu)恢復(fù)系Q611為供體親本與生產(chǎn)上大面積應(yīng)用的優(yōu)質(zhì)或多抗的優(yōu)良恢復(fù)系直接進行雜交，在F2或回交F2進行分子標記輔助選擇，并將篩選的優(yōu)良單株與不育系進行測交鑒定，比直接從普通野生稻中導(dǎo)入高產(chǎn)基因更容易穩(wěn)定，中選的優(yōu)良單株幾率大大提高。玉米分子標記輔助育種研究證實，在雜交育種的早期世代就可以開展分子標記輔助選擇21。但僅僅根據(jù)分子標記進行選擇并不太有效，分子標記分析必須與田間選擇相結(jié)合方可明顯提高效率。5 野生稻高產(chǎn)基因分子育種效果由于野生稻高產(chǎn)基因yld1.1和yl

19、d2.1都是具有顯著增產(chǎn)效應(yīng)的主效QTL，因此借助分子標記輔助選擇將其轉(zhuǎn)入優(yōu)良恢復(fù)系中，培育具有超高產(chǎn)潛力的雜交水稻新組合，從技術(shù)上講是完全可行的。近年來，我們借助SSR等標記技術(shù)著手將兩個高產(chǎn)QTL先后轉(zhuǎn)移到優(yōu)良恢復(fù)系測64-7、9311、明恢63等遺傳背景中，并逐步建立近等基因系，已經(jīng)培育了一批強優(yōu)恢復(fù)系材料，對部分材料進行了測交鑒定，其雜種F1表現(xiàn)出強大的雜種優(yōu)勢，有望培育出超高產(chǎn)雜交稻新組合。以優(yōu)良恢復(fù)系測64-7為受體的分子標記輔助育種為例，先以受體親本與野生稻高產(chǎn)基因供體材料（來源于野生稻V20B回交系與測64-7的測交后代，即V20A/rufipogon/V20B/V20B /C

20、e64）雜交、回交，在每個回交世代分單株提取基因組DNA，然后以與緊密連鎖的SSR標記進行擴增、分析，篩選在這兩個位點含有野生稻擴增帶的雜合基因型單株，再以受體親本為輪回親本連續(xù)回交至BC3F1。自交多代后，主要根據(jù)農(nóng)藝性狀進行田間選擇，篩選優(yōu)良單株與V20A、金23A等三系不育系測交，根據(jù)大量測交F1的產(chǎn)量表現(xiàn)再決選恢復(fù)系株系，并進一步通過分子標記驗證野生稻高產(chǎn)基因的存在與否。5.1 田間選擇和雜種優(yōu)勢表現(xiàn)在以測64-7為受體的BC3F1中篩選了7個優(yōu)良單株，種植成7個株系，每個株系200株以上，并從中篩選優(yōu)良單株自交。以后每個世代根據(jù)綜合農(nóng)藝性狀篩選優(yōu)良單株自交。2000年從BC3F5中篩

21、選到2個性狀非常優(yōu)良的株系Q608和Q611，測交鑒定表明，2個株系均具有強大的雜種優(yōu)勢。但進一步測交、制種試驗顯示，Q608本身容易受低溫影響，結(jié)實率很不穩(wěn)定，予以淘汰。而另一個株系Q611則結(jié)實穩(wěn)定，花粉量足，與具有長江流域早秈稻遺傳背景的不育系測交表現(xiàn)出強大的雜種優(yōu)勢，是配制三系超級雜交稻的強優(yōu)恢復(fù)系。2001年小區(qū)品比試驗，金23A/Q611比對照組合威優(yōu)77增產(chǎn)30%以上。2002年在進一步篩選、穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，繼續(xù)測配組合進行品比和生產(chǎn)試驗，在大田栽培條件下，金23A/Q611同樣表現(xiàn)出強大的雜種優(yōu)勢，作雙季晚稻栽培單產(chǎn)可獲10.5 t/hm2以上，作一季晚稻栽培產(chǎn)量可達12.0 t

22、/hm2，具有超高產(chǎn)的產(chǎn)量潛力。2003年作雙季晚稻栽培的“百畝示范片”單位面積產(chǎn)量比對照增加20%以上，大面積平均單產(chǎn)達9.75 t/hm2以上，高產(chǎn)丘塊可達10.5 t/ham2以上（表1）。表1 金優(yōu)611百畝示范栽培產(chǎn)量結(jié)構(gòu)（2003）Table 1. Yield components of hybrid J611 on demonstration field (2003)示范戶主Field owner面積area(m2)播種期/月-日Sowing date/M-D有效穗 /穗·m-2Productive panicles.m-2每穗總粒數(shù)Spikelets per pani

23、cle結(jié)實率Seed setting rate/%千粒重1000-grain weight/g理論產(chǎn)量Yield estimated/t·hm-2實際產(chǎn)量Actual yield/t·hm-2熊國安Xiong GA133306-16273.3195.684.826.011.810.5蔣德龍Jiang DL80006-19257.7200.283.225.811.110.0蔣雪階Jiang XJ100006-20249.6199.885.226.311.29.4熊國輝Xiong GH133306-20257.4186.084.926.010.69.8蔣德虎Jiang DF10

24、0006-20255.3207.981.225.911.29.9威優(yōu)46V/46(CK)73306-18268.8113.189.931.18.57.55.2 分子標記分析和驗證經(jīng)多態(tài)性分析，篩選在供體與受體親本間具有多態(tài)性，同時與yld1.1緊密連鎖的RM9和RM306，以及與yld2.1緊密連鎖的RM166和RM208等4個SSR標記，對Q611不同株系進行分子標記分析。RM9和RM306位于第1染色體，它們與yld1.1分別相距2.5 cM和3.2 cM；RM166和RM208位于第2染色體，與yld2.1分別相距3.1 cM、6.5 cM。分析結(jié)果顯示：選出的Q611不同株系在上述4個

25、標記位點都具有來自普通野生稻的擴增帶型。在BC3F7有47.2%的單株在第2染色體的RM166位點顯示野生稻擴增帶型，篩選到75株在該位點純合的單株。繼續(xù)以另外3個分子標記擴增，篩選到15個在所有4個標記位點均具有野生稻擴增帶型(圖1, 圖2)，并且農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的單株。經(jīng)測交鑒定和進一步自交穩(wěn)定篩選，最終培育成強優(yōu)恢復(fù)系Q611，用于大面積制種和雜種生產(chǎn)示范。500bp250bpM 1 2 3 4.16圖1 對Q611 BC3F7以RM166為引物擴增的部分結(jié)果M：DNA 分子量標記; 第1列：野生稻; 第2列：V20B; 第3列：測64-7; 第416列：Q611株系的不同單株。箭頭指示野生

26、稻特異帶。Fig. 1 Partial results screened by marker RM166 in Q611 BC3F7. M, DNA size marker; lane 1,rufpogon; lane 2, V20B; lane 3, Ce64; lane 416, individuals of Q611 family. Arrows indicate the specific bands of O. rufipogon250bp100bpM 1 2 3 4.16圖2 對Q611 BC3F7以RM9為引物擴增的部分結(jié)果M：DNA 分子量標記; 第1列：野生稻; 第2列：V20

27、B; 第3列：測64-7; 第416列：Q611株系的不同單株。箭頭指示野生稻特異帶。Fig. 2 Partial results screened by marker RM9 in Q611 BC3F7 .M, DNA size marker; lane 1, rufpogon; lane 2, V20B; lane 3, Ce64; lane 416, individuals of Q611 family. Arrows indicate the specific bands of O. rufipogon6 結(jié)語形態(tài)改良與雜種優(yōu)勢相結(jié)合是進一步實施水稻產(chǎn)量性狀遺傳改良的一條最有效的技術(shù)路

28、線22。它包含兩層含義：（1）通過育種途徑進一步塑造水稻理想株葉形態(tài)，提高群體光能利用率；（2）進一步擴大雜種雙親遺傳差異，提升水稻雜種優(yōu)勢利用水平。在現(xiàn)階段除繼續(xù)深入研究秈、粳亞種間雜種優(yōu)勢利用外，借助現(xiàn)代生物技術(shù)手段如MAS等將水稻野生近緣種中的有利基因轉(zhuǎn)移到現(xiàn)有超高產(chǎn)雜交稻親本中，這些有利基因不僅可直接改良水稻產(chǎn)量性狀、抗性等，還可增加現(xiàn)代栽培品種的遺傳多樣性，有利于進一步提高水稻雜種優(yōu)勢利用水平。因此，近年來MAS已成為植物育種領(lǐng)域的研究熱點之一。然而，應(yīng)清醒地認識到，分子標記技術(shù)只是起輔助作用，輔助選擇還離不開常規(guī)育種手段。就目前的發(fā)展現(xiàn)狀而言，分子標記輔助育種的理論問題已研究不少，

29、但實際應(yīng)用分子標記于具體的育種項目還處于進一步探索階段。本項目的初步成功，在水稻產(chǎn)量性狀遺傳改良方面是一種突破性進展，展示了該領(lǐng)域的誘人前景，但今后還必須作更深入的研究，以證實這一新途徑的廣泛育種價值。致謝本研究獲得國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(2001AA211071-3)，國家自然科學基金(30270819)和湖南省自然科學基金(00JJY1003)資助; 本研究的早期材料收集和構(gòu)建得到美國洛克菲勒（the Rockefeller Foundation）基金資助。在此一并致謝。參考文獻：1. Khush G S, Ling K C, Aquino R C, et al. Breeding for

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