通腑法開通玄府對大鼠腦缺血再灌注損傷血腦屏障及腦組織水通道蛋

1、通腑法開通玄府對大鼠腦缺血再灌注損傷血腦屏障及腦組織水通道蛋 作者：胡建芳， 余志輝， 汪峰， 黃培新， 尤勁松 【摘要】 目的研究通腑醒神膠囊（簡稱TFXSJN）通腑法開通玄府對大鼠大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，簡稱MCAO）再灌注損傷模型血腦屏障（blood brain barrier， 簡稱BBB）通透性及腦組織水通道蛋白作者：胡建芳， 余志輝， 汪峰， 黃培新， 尤勁松【摘要】 目的研究通腑醒神膠囊（簡稱TFXSJN）通腑法開通玄府對大鼠大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，簡稱MCAO）再

2、灌注損傷模型血腦屏障（blood brain barrier， 簡稱BBB）通透性及腦組織水通道蛋白4（Aquaporin-4，簡稱AQP4）mRNA表達(dá)的影響。方法采用線栓法制作大鼠MCAO模型,2 h后拔線造成缺血再灌注損傷。大鼠處死前2 h經(jīng)股靜脈注射伊文思藍(lán)（Evans Blue，簡稱EB）并測量各組大鼠1，3 d及7 d時腦EB含量，以及拔線后12 h，1，2，3 d及7 d時間點大鼠神經(jīng)行為評分、腦組織AQP4mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果TFXSJN治療后能明顯減輕大鼠在1，2，3 d及7 d時的神經(jīng)功能評分，與模型組相比有明顯差異（P0.05或P0.05）；TFXSJN組及模型組大鼠

3、腦組織損傷側(cè)AQP4 mRNA的表達(dá)在12 h時已經(jīng)明顯升高，與健側(cè)、假手術(shù)組及正常組相比均具有顯著性差異（P0.01）；模型組在3 d時達(dá)高峰，TFXSJN組在2 d時達(dá)高峰，3 d時已有所下降，與模型組損傷側(cè)相比有明顯差異（P0.05），但仍高于健側(cè)（P0.05）。假手術(shù)組在各時點內(nèi)其損傷側(cè)AQP4 mRNA表達(dá)水平與健側(cè)及正常組相比均無明顯差異（P0.05）。結(jié)論腦急性缺血再灌注損傷時存在BBB通透性的增高和AQP4 mRNA基因表達(dá)的上調(diào)。而TFXSJN通腑法開通玄府法能夠調(diào)節(jié)缺血再灌注損傷后BBB通透性增高與AQP4 mRNA表達(dá)的失衡，減輕缺血再灌注損傷，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。其調(diào)

4、節(jié)BBB通透性與AQP4mRNA基因的異常表達(dá)可能是通腑法開通玄府治療缺血性中風(fēng)的分子機制之一。因此推測玄府與BBB及細(xì)胞膜上通道蛋白（如AQP4等）之間可能存在共同的實質(zhì)內(nèi)涵。 【關(guān)鍵詞】 腑法 開通玄府 缺血再灌注損傷 血腦屏障 腦組織水通道蛋白4 中醫(yī)認(rèn)為中風(fēng)病存在玄府郁閉的病理狀態(tài)，通腑法的目的在于開通玄府，調(diào)節(jié)玄府功能。而對于玄府本質(zhì)的認(rèn)識，現(xiàn)代醫(yī)家認(rèn)為玄府是機體內(nèi)最微小的腔道，在結(jié)構(gòu)及功能上體現(xiàn)了“孔”“縫隙”的內(nèi)涵實質(zhì)，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的細(xì)胞間隙十分相似，與微循環(huán)、離子通道有著許多共性內(nèi)涵1,2。因此，本實驗旨在研究TFXSJN通腑法開通玄府對大鼠急性局灶性腦缺血再灌注損傷模型的治療作

5、用及其對BBB通透性和神經(jīng)細(xì)胞膜上AQP4 mRNA基因表達(dá)的影響，試圖從調(diào)節(jié)BBB通透性及細(xì)胞膜上通道蛋白表達(dá)的異常來詮釋通腑法開通玄府治療急性缺血性中風(fēng)的可能作用機制，探討通腑法開通玄府與BBB及神經(jīng)細(xì)胞膜上通道蛋白之間的相關(guān)性，有助于從現(xiàn)代科學(xué)的微觀指標(biāo)解釋通腑法的實質(zhì)內(nèi)涵，為中風(fēng)病的現(xiàn)代化研究及中西結(jié)合找到切入點和開拓新思路。1 材料與儀器1.1 動物及藥物SPF級雄性SD大鼠，體重250300 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供（合格證編號：0014930）。TFXSJN由廣東省中醫(yī)院制劑科提供（由番瀉葉、虎杖、人工牛黃、天竺黃、栝蔞仁等藥物組成）。1.2 材料及試劑TRIZOL

6、(美國sigma 公司產(chǎn)品)、DEPC(美國sigma 公司產(chǎn)品)、玻璃勻漿器、1.5 ml Eppendorf管、氯仿、異丙醇、無水乙醇、2伊文思藍(lán)、甲酰胺、超低溫離心機(BE CKMAN QS-15R Centrifuge)、螺旋振蕩器、70冰箱、紫外分光光度計(Ultrospec4000)、1.5%瓊脂糖凝膠、SSIII逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司產(chǎn)品)、PCR擴(kuò)增試劑盒(北京天為時代公司產(chǎn)品)、AQP-4上、下游引物及探針（序列參考相關(guān)文獻(xiàn)，由上海生工合成）、PE7000全自動熒光定量PCR儀。2 方法2.1 分組與給藥SPF級雄性SD大鼠138只，體重250300 g。隨機

7、分為正常組（n6）、假手術(shù)組（n36）、模型組（n48）、TFXSJN組（n48）。TFXSJN按大鼠1.5g/kgd計算藥量，按動物系數(shù)折算，相當(dāng)于70 kg成人臨床劑量的3倍。均于術(shù)前一天及術(shù)后麻醉清醒后，每日分兩次灌胃給藥（TFXSJN組）或者蒸餾水（正常組，假手術(shù)組，模型組），2 ml/次，上下午各1次。各組動物如有死亡應(yīng)及時補充。2.2 MCAO缺血再灌注大鼠模型建立大鼠MCAO模型制作參照koizumi線栓法3，從右側(cè)頸總動脈（Common carotid artery，簡稱CCA）進(jìn)線，栓線采用尼龍漁線，長約4 cm，直徑約0.26 mm，進(jìn)線深度約1.8 cm,術(shù)后2 h拔出線

8、栓約1.5 cm形成缺血再灌注損傷。大鼠術(shù)中及清醒前均給予白熾燈（100 W）照射，保持肛溫36左右，室溫25。假手術(shù)組漁線插入CCA深度為0.5 cm，其余操作均同手術(shù)組。各組動物如有死亡應(yīng)及時補充。2.3 腦組織伊文思藍(lán)(Evans Blue，EB)含量的測定1，3 d及7 d時每組各取6只大鼠，于處死前2 h經(jīng)股靜脈注射2伊文思藍(lán)2 ml/kg，2 h后開胸通過左心室灌注生理鹽水(灌注壓為100 mm Hg)，直到右心房流出無色液體為止，迅速斷頭取腦，分開大腦半球，去除蛛網(wǎng)膜、血凝塊及腦室脈絡(luò)叢，測量右側(cè)大腦半球的重量并記錄，置已知體積的甲酰胺中，測量腦體積，繼續(xù)加甲酰胺至腦體積的5倍，置37水