血脂康預處理對心肌缺血再灌注大鼠炎癥因子影響

1、血脂康預處理對心肌缺血再灌注大鼠炎癥因子影響        【摘要】 目的 觀察血脂康預處理對急性心肌缺血再灌注損傷大鼠炎癥因子的影響，探討其可能的作用機制。方法 健康SD大鼠32只，隨機分為空白組、假手術組、缺血再灌注組和血脂康預處理組，各8只。血脂康預處理組每天灌胃給予血脂康膠囊0.09 g/kg，其余各組給予            【摘要】  目的 觀察血脂康預處理對急性心肌缺血再

2、灌注損傷大鼠炎癥因子的影響，探討其可能的作用機制。方法 健康SD大鼠32只，隨機分為空白組、假手術組、缺血再灌注組和血脂康預處理組，各8只。血脂康預處理組每天灌胃給予血脂康膠囊0.09 g/kg，其余各組給予等量生理鹽水，連續(xù)7 d。缺血再灌注組和血脂康預處理組大鼠均開胸并結扎冠狀動脈前降支30 min，然后再通60 min;假手術組只開胸不結扎冠狀動脈，空白組不做任何處理。采集大鼠腹主動脈血，分離血清，檢測白細胞介素(IL)1、IL4、IL8、腫瘤壞死因子(TNF)、肌酸激酶同工酶(CKMB)、肌鈣蛋白I (cTNI)含量，并處死動物取出心臟，計算心肌梗死面積。結果 缺血再灌注組IL1、IL

3、4、IL8、TNF、CKMB和cTNI血清含量均明顯高于空白組和假手術組(F=48.72351.07,q=0.2541.65,P<0.01);而血脂康預處理組上述指標除IL4外均低于缺血再灌注損傷組(q=0.3532.65,P<0.05)，且血脂康預處理組大鼠心肌梗死面積小于缺血再灌注損傷組(F=231.26,q=17.21,P<0.05)。結論 血脂康能抑制促炎因子IL1、IL8、TNF的生成，并增加抗炎因子IL4生成，減輕心肌缺血再灌注損傷，對缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用。 【關鍵詞】  心肌;再灌注損傷;炎癥;白細胞介素類;大鼠,SpragueDawley

4、ABSTRACT Objective To observe the effects of Xuezhikang capsules on inflammatory factor of myocardial ischemiareperfusion injury (MIRI) in rats and explore its possible mechanism of action. Methods Thirtytwo SD rats were evenly randomized to four groups: blank group, shamoperation group, MIRI group

5、and Xuezhikang pretreatment group. The rats in Xuezhikang group were treated with Xuezhikang (0.09 g·kg-1·d-1, gastric gavage) and other groups were treated with the same amount of saline, for 7 days. Those in MIRI and Xuezhikang pretreatment groups underwent a thoracotomy and the left ant

6、erior descending branch of coronary artery was ligated for 30 minutes and then recanalized for 60 minutes; those in shamoperation group received only thoracotomy with no ligation of coronary artery; no any management was done for those in the blank group. Blood samples were extracted from the abdomi

7、nal aorta, and the serum separated. The interleukin1 (IL1), IL4, IL8, tumor necrosis factor alpha (TNF), creatine kinaseMB (CKMB), and troponinI were detected. The area of myocardial infarction (MI) was calculated. Results In MIRI group, the serum levels of IL1, IL4, IL8, TNF, CKMB, and cTNI were si

8、gnificantly higher than those of normal group and shamoperation group (F=48.72-351.07，q=0.25-41.65，P<0.01), while the above parameters in the pretreatment group were lower than those of MIRI group, except IL4 (F=48.72-351,q=0.35-32.65,P<0.05). The area of MI in Xuezhikang pretreatment group wa

9、s smaller than those in the MIRI (F=231.26，q=17.21，P<0.05). ConclusionXuezhikang can inhibit the production of proinflammatory factors, such as IL1, IL8 and TNF, and increase antiinflammatory IL4, thus lessening ischemiareperfusion inflammatory reaction and injury.KEY WORDS myocardium; reperfusio

10、n injury; inflammation; interleukins; rats, SpragueDawley在心血管疾病治療過程中，許多新的治療措施都不可避免地造成缺血再灌注損傷，因此缺血再灌注時的心肌保護越來越成為心血管領域的研究熱點。心肌缺血再灌注損傷是一個復雜的病理生理過程，氧自由基、鈣超載、粒細胞浸潤等都可能參與再灌注損傷的過程，對急性心肌梗死行早期心肌再灌注可挽救瀕死心肌，但再灌注本身也會造成肌細胞損傷，即缺血再灌注損傷1。已有研究表明，急性心肌缺血再灌注損傷與炎癥密切相關，炎癥在心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。血脂康是從特制的中藥紅曲中提煉而成，是我國自主開發(fā)

11、研制的具有他汀類降脂作用的中藥，富含羥甲基戊二酰輔酶A(HMGCoA)還原酶抑制劑(洛伐他汀)、多種不飽和脂肪酸、人體必需氨基酸、甾醇和少量黃酮等多種有效成分，除具有降低血脂、防治動脈硬化功能外，還具有抑制巨噬細胞分泌、抗炎等作用。本文研究了血脂康對冠狀動脈結扎及再通誘發(fā)的大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用，現(xiàn)將結果報告如下。1 材料與方法1.1 實驗動物及分組健康成年SD大鼠32只，體質量200250 g，隨機分成空白組、假手術組、缺血再灌注組和血脂康預處理組，每組8只。所有動物均自由飲食，血脂康預處理組以血脂康0.09 g/kg溶于生理鹽水灌胃，連續(xù)1周后行缺血再灌注術。其余各組給予等量生理

12、鹽水灌胃。1.2 動物模型制備按文獻23方法，建立大鼠心肌缺血再灌注損傷(MIRI)模型。大鼠以100 g/L水合氯醛腹腔麻醉(4 mL/kg)，剪毛后切開頸部，分離氣管，氣管插管成功后連接小型動物呼吸機,連接壓力換能器(BL420生物信號采集處理系統(tǒng)，成都泰盟科技有限工程公司生產)。于胸骨左緣切開皮膚，逐層分離，剪斷第3肋骨，打開胸腔，剪破心包，暴露心臟，于冠狀動脈前降支(LAD)根部穿線穩(wěn)定10 min后，將一塑料凹槽與LAD并列，結扎，30 min后沿凹槽剪斷結扎線，再灌注60 min后打開腹腔，于腹主動脈采血備用。缺血標志為T波增高(>0.2 mV)，再灌注的標志為T波下降。假手

13、術組只開胸不結扎冠狀動脈，空白組不做任何處理。1.3 炎癥因子檢測方法缺血再灌注組及血脂康預處理組大鼠均于再灌注60 min后,腹主動脈取血，以3 000 r/min離心15 min，分離血清-20 保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定肌鈣蛋白I(cTNI)、肌酸激酶同工酶(CKMB)(試劑盒均購自南京建成生物工程研究所)和白細胞介素(IL)、IL4、IL8、腫瘤壞死因子(TNF)水平(試劑盒為美國R&D公司產品)，嚴格按試劑盒說明書進行操作。1.4 心電圖ST段測定    選擇ST段抬高明顯的導聯(lián)記錄心電圖。 1.5 心肌梗死面積檢測 實驗結束前結扎左

14、冠狀動脈，0.1 g/L伊文藍注入左心室內，取出心臟，用緩沖液沖洗，冷凍后將其橫斷面切成1 mm的切片，用0.25 mmol/L四唑氮藍(NBT)染色10            選擇ST段抬高明顯的導聯(lián)記錄心電圖。1.5 心肌梗死面積檢測實驗結束前結扎左冠狀動脈，0.1 g/L伊文藍注入左心室內，取出心臟，用緩沖液沖洗，冷凍后將其橫斷面切成1 mm的切片，用0.25 mmol/L四唑氮藍(NBT)染色10 min。測定伊文藍未染色區(qū)心肌組織質量，代表心肌缺血危險區(qū)質量;同時測

15、定NBT區(qū)心肌組織質量，代表梗死區(qū)質量。以梗死區(qū)心肌與心肌缺血危險區(qū)心肌質量的百分比表示心肌梗死范圍。1.6 統(tǒng)計學處理應用SPSS 16及PPMS 1.54統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以±s表示，兩組間比較用t檢驗,多組間比較使用方差分析，以P<0.05為差異有顯著性。2 結 果2.1 各組心電圖變化空白組與假手術組心電圖無明顯改變，缺血再灌注組與血脂康預處理組前降支結扎前后ST段抬高及T波改變顯著。于導聯(lián)選擇5次心搏動計算ST段抬高毫伏平均數(shù),缺血再灌注組ST段較空白組及假手術組明顯抬高(q=0.2512.31,P<0.01)，而血脂康預處理組ST段較缺血再灌注組降

16、低(q=9.01,P<0.05)。見表1。2.2 各組心肌梗死面積比較缺血再灌注組及血脂康預處理組的心肌梗死面積均顯著大于空白組及假手術組(F=231.26，q=1.0920.11,P<0.01);而血脂康預處理組心肌梗死面積小于缺血再灌注組(F=231.26,q=17.21,P<0.05)。見表1。鏡下見缺血再灌注組細胞病變較重，心肌纖維失去正常形態(tài);而血脂康預處理組心肌纖維排列較整齊,有輕度腫脹,核形狀較規(guī)則,病變減輕,表明血脂康能減輕缺血再灌注心肌損傷。2.3 各組心肌酶檢測結果比較與空白組及假手術組比較，缺血再灌注組大鼠CKMB和cTNI含量明顯升高，差異有顯著性(F

17、=97.28153.04,q=1.4931.40,P<0.01);而血脂康預處理組上述指標均較缺血再灌注組下降，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(q=2.3428.31,P<0.05)。見表1。2.4 各組炎癥因子檢測結果比較缺血再灌注組血清IL1、IL8、cTNI、TNF均高于空白組與假手術組(F=55.92351.07,q=1.7741.65,P<0.01);與缺血再灌注組比，血脂康預處理組上述炎癥因子水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(F=55.92351.07,q=13.1129.17,P<0.01);血脂康預處理組IL4的水平明顯高于其他3組(F=197.89,q=25.26

18、,P<0.05)。見表2。表1 各組心肌梗死面積、心電圖ST段抬高及心肌酶檢測結果(n=8,±s)組 別心肌梗死面積表2 各組血清IL1、IL4、TNF、IL8水平的檢測結果3 討 論心肌缺血再灌注損傷是常見的復雜的病理生理過程，其機制與氧自由基、炎細胞激活等因素有關。研究顯示，心肌缺血再灌注時伴隨血漿炎性細胞因子及抗炎細胞因子的升高(其增高程度和心肌微循環(huán)的損傷程度有關)，心肌組織水平灌注不良越嚴重，細胞因子升高越明顯;且抗炎細胞因子的升幅遠低于炎性細胞因子5。IL1是一種來源廣泛的多功能的細胞因子，參與多種炎癥反應，促進組織損傷。SIMON等6的研究結果證明，不穩(wěn)定型心絞痛

19、病人ILl濃度顯著高于穩(wěn)定型心絞痛及無癥狀病人。正常情況下，IL1在血液中含量很低，而在生物、理化因素的誘導下，單核細胞、巨噬細胞、內皮細胞等均能表達及釋放IL1。大量研究表明，中性粒細胞浸潤在心肌缺血再灌注損傷的病理發(fā)展中扮演重要角色。中性粒細胞在缺血再灌注過程中聚集于心肌，通過一系列機制造成組織細胞的損傷和功能的喪失，IL1能刺激血管內皮細胞表達細胞間黏附分子1，促進中性粒細胞和內皮細胞的黏附，誘導中性粒細胞黏附在內皮細胞和內皮下基質并穿過內皮細胞遷入缺血區(qū)，通過阻塞微血管、釋放氧自由基等機制導致心肌細胞損傷。本實驗缺血再灌注組IL1水平較空白組及假手術組顯著升高，進一步證實了IL1在急性

20、心肌缺血損傷中的作用;而血脂康預處理組IL1水平較缺血再灌注組明顯下降，證明了血脂康能降低IL1水平，抑制心肌急性缺血再灌注時的炎癥反應，起到對心肌缺血再灌注的保護作用。TNF是缺血再灌注損傷連鎖反應中的關鍵性遞質，能誘導白細胞聚集和釋放IL6、IL8、血小板活化因子、白三烯等炎癥遞質，誘發(fā)缺血再灌注損傷。IL8是一種重要的促炎因子，心肌缺血再灌注后IL8升高并持續(xù)較長時間，血清IL8濃度可反映心肌損傷。本研究結果顯示，缺血再灌注損傷時，TNF、IL8均顯著升高;而血脂康預處理后，TNF、IL8均顯著降低。提示血脂康通過抑制TNF、IL8釋放，從而減輕炎癥反應，發(fā)揮對缺血再灌注心肌的保護作用。

21、IL4被普遍認為是抗炎細胞因子,是由Th2細胞分泌的細胞因子，是B淋巴細胞生長和分化因子。它可抑制Thl細胞分泌IL6、TNFa等促炎因子，研究結果表明Th2細胞有重要的抗炎作用，而且Th2也可通過負調節(jié)機制抑制Thl細胞介導的免疫反應而發(fā)揮抗炎作用。賈興旺等7研究顯示，冠心病病人血漿中IL4含量低于正常組，且急性心肌梗死病人IL4顯著低于正常人。本研究結果顯示，缺血再灌注組血清IL4水平低于空白組和假手術組，提示機體冠狀動脈炎癥及其防御性反應失平衡。血脂康預處理組IL4較其他3組明顯升高，證明血脂康預處理可增高血清IL4含量，進而通過抑制細胞因子、趨化因子等炎癥遞質的產生而發(fā)揮對心肌缺血再灌

22、注的保護作用。缺血再灌注時劇增的氧自由基加重細胞膜的損傷，細胞內CKMB、cTNI釋放入血，引起相應酶在血液中濃度升高，這些酶釋放入血的多少與心肌壞死程度呈正相關8，故測定其血清含量被認為有助于心肌缺血損傷程度的診斷。本研究顯示，缺血再灌注損傷時，CKMB、cTNI均顯著升高，心肌梗死面積顯著增大，表明缺血再灌注后心肌不可逆損傷加劇，以致壞死溶解的心肌釋放CKMB、cTNI明顯增多;而血脂康預處理后,CKMB、cTNT均顯著降低，說明血脂康可減輕心肌細胞膜的損傷，降低心肌酶的釋放。其機制可能是通過抑制炎癥反應、減少氧自由基的生成，從而減輕心肌細胞損傷。綜上所述，血脂康可能通過抑制促炎因子的生成，同時增加血清抗炎因子含量，從而抑制PMNs的遷移、浸潤和激活，減輕缺血再灌注時炎癥反應，進而減少心肌缺血再灌注的心肌損傷，發(fā)揮對缺血再灌注的保護作用，提示血脂康可用于缺血性心血管疾病的治療?！緟⒖嘉墨I】  1劉付平,姚宏偉,李俊. 大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的改進J. 安徽醫(yī)科大學學報, 2003,38(3):234236.    2高治平,胡弼. 現(xiàn)代實用醫(yī)學機能實驗技術與方法M. 長沙：湖南科學技術出版社, 2003：5657. 3李國營