表皮生長因子受體酪氨酸激酶的克隆表達(dá)和酶抑制劑篩選模型的構(gòu)建

1、中國生物工程雜志 China B i otechnol ogy, 2008, 28(10 :1217研究報(bào)告表皮生長因子受體酪氨酸激酶的克隆表達(dá)和酶抑制劑篩選模型的構(gòu)建3張 洋 劉春平 李 元33(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究所 北京 100050摘要 表皮生長因子受體 (ep ider gr 屬受體酪氨酸激酶 (tyr osine kinase, TK 家族 , 。許多腫瘤的發(fā)生 、 。因此 , EGFR 胞內(nèi)酪氨酸激酶的抑 。從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC 提取總 RNA , 采用 RT 2PCR 獲得 EGFR 酪氨酸激酶催化域的編碼基因 。 將其克隆至載體 pET

2、230a, 在 E . coli BL21(DE3中進(jìn)行了成功表達(dá) , 采用 N i 2NT A 親和層析對其進(jìn)行了純化 。通過對酶的活性的測定 , 證明重組 EGFR 酪氨酸激酶蛋白具有利用 ATP 催化底物發(fā)生磷酸化反應(yīng)的激酶活性 。以該重組激酶為靶位構(gòu)建了酶抑制劑篩選模型 , 擬對微生物代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩選 。 關(guān)鍵詞 EGFR 酪氨酸激酶 克隆表達(dá) 重組蛋白 抑制劑篩選模型中圖分類號(hào) Q786收稿日期 :2008206224 修回日期 :2008208204 EGFR 廣泛分布于哺乳動(dòng)物的上皮細(xì)胞 、 人的成纖 維細(xì)胞 、 膠質(zhì)細(xì)胞 、 角質(zhì)細(xì)胞等 , 并在多種上皮腫瘤細(xì) 胞中過度表達(dá)1。

3、 EGFR 高表達(dá)的腫瘤患者 , 腫瘤惡性程度高 , 患者存活期短 2。人的 EGFR 基因定位于第 7號(hào)染色體的短臂 (7p12. 32p12. 1 , 它 的 編碼 產(chǎn) 物由1210個(gè)氨基酸組成 , 是一種分子量約為 170kDa 的糖蛋白 , 由胞外結(jié)構(gòu)域 、 跨膜區(qū)及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成3, 其中712979位氨基酸屬于酪氨酸激酶區(qū)4。 EGFR 酪氨酸激酶能催化 ATP 的 磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至許多重要蛋白 質(zhì)的酪氨酸殘基上5, 使其發(fā)生磷酸化 , 進(jìn)而導(dǎo)致信號(hào)的傳導(dǎo)級(jí)聯(lián) 。 據(jù)了解 50%以上的原癌基因和癌基因產(chǎn) 物都具有蛋白酪氨酸激酶活性 , 它們的異常表達(dá)導(dǎo)致 細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂 , 進(jìn)

4、而促使腫瘤發(fā)生 6。因此 ,以 EGFR 2TK 為靶位進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)和篩選可能成為腫瘤治療的有效途徑之一 。 本研究將人源 EGFR 酪氨酸激酶催化域在 E. oliBL21(DE3 中成功進(jìn)行了表達(dá) , 采用 N i 2NT A 親和層析對蛋白進(jìn)行了純化 , 并對重組蛋白的酪氨酸激酶活性 進(jìn)行了優(yōu)化條件研究 , 以其為靶點(diǎn)構(gòu)建了酶抑制劑篩 選模型 , 對微生物產(chǎn)物進(jìn)行篩選 , 為抗腫瘤新藥的研制 奠定了一定基礎(chǔ)。1 材料與方法1. 1 材 料1. 1. 1 質(zhì)粒 、 菌株和細(xì)胞株 質(zhì)粒 pET 230a 及大腸桿菌 BL21(DE3 由本室保存 , HUVEC 細(xì)胞由本所腫瘤室 保存。1.

5、1. 2 酶與主要試劑 限制性內(nèi)切酶、 T4DNA 連接酶、 pfu DNA 聚合酶購自 Pr omega 或 TaKaRa 公司 ; 抗H is 2tag 的單克隆抗體 、 磷酸化的酪氨酸單克隆抗體購于 Santa crunz 公司 ; 山羊抗小鼠堿性磷酸酶標(biāo)記的二 抗購自中山試劑公司 ; Hepes, 合成肽底物 poly (Glu,Tyr 4 1和 Na 3VO 4購自 Sigma 公司 ; TR I zol 為 I nvitrogen 2008, 28(10 張 洋 等 :表皮生長因子受體酪氨酸激酶的克隆表達(dá)和酶抑制劑篩選模型的構(gòu)建公司 產(chǎn) 品 ; NBT/BCI P 購 自 Pr o

6、mega 公 司 ; IPTG 購 自 MERCK 公 司。 UN I Q 210柱 式 DNA 膠 回 收 試 劑 盒 (Sangon 公司 。1. 2 方 法1. 2. 1 EGFR 2TK 基因的獲得和重組質(zhì)粒 pET 230a / EGFR 2TK 的構(gòu)建 采用 TR Izol 試劑從人臍靜脈內(nèi)皮 細(xì)胞 (HUVEC 提取總 RNA 。采用兩步法 RT 2PCR 試 劑盒 (TaKaRa , 以 O ligo (dT 2adap tor 為 RT 引物進(jìn)行 反轉(zhuǎn)錄 , 反應(yīng)條件為 :30 10m in, 42 30m in, 99 5m in, 10 5m in 。根據(jù)已知的 EGFR

7、 2TK 基因序列設(shè) 計(jì)引物 , 引物 1為 5 CAGG AG AGGG AGC TTGT 3 , 引物 2為 5 TT AGG AGTCTGT A GG ACTTGGC 3 (下劃線分別為 Kpn I 和 in d點(diǎn) 。 采用上述引物 , , 按下述條件進(jìn)行 2m 30s, 61 30s 和 72 1s, 30循環(huán) ; 最后 72 延伸 4 m in 。 擴(kuò)增的 EGFR 2TK 基因片段用 UN I Q 210柱式 DNA 膠回收試劑盒回收 , 以 Kpn I 2H in d III 雙酶切該片段 , 克 隆至 Kpn I 2H in d III 酶切的 pET 230a, 轉(zhuǎn)化至 E.

8、 coli BL21 (DE3 感受態(tài)細(xì)胞 , 從轉(zhuǎn)化子 (Ka r 分離獲得重組質(zhì)粒 pET 230a /EGFR2TK, 酶切檢定并進(jìn)行序列測定 。 1. 2. 2 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組菌 E. coli BL21 pET 230a /EGFR 2TK接種至含卡那霉素 (25g/ml 的 LB 培養(yǎng)基中 , 37 培養(yǎng)過夜。按 1%的接種量轉(zhuǎn)接到 含卡那霉素的新鮮 LB 培養(yǎng)基中 , 37 培養(yǎng)至 OD 600為0. 61. 0, 采用不同濃度 I PTG 和不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行誘 導(dǎo)表達(dá) , 以確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)蛋白條件 。1. 2. 3 重組蛋白包含體的復(fù)性和純化 (1 重組蛋白 的復(fù)性

9、 將上述菌 4 4000r/min 離心 10m in, 取菌體 懸浮于緩沖液 (50mmol/LTris 2HCl pH 8. 5, 5mmol/L EDT A , 150mmol/LNaCl, 1%Triton X 2100 , 置冰浴進(jìn)行 超聲波破碎 , 4 10000r/min 離心 10m in 棄上清 。將沉 淀用 包 含 體 洗 滌 液 (50mmol/LTris 2HCl pH 8. 5, 5mmol/LEDT A, 150mmol/LNaCl, 1%Trit on X 2100, 5mol/L尿素 洗滌后 , 4 10000r/min 離心 10m in 棄上 清 , 重復(fù)上

10、述步驟 2次 。按濕重 50m l/g 的比例將包含 體加至裂解液中 (50mmol/LTris 2HCl, pH8. 5, 5mmol/L EDT A , 150mmol /LNaCl, 3mol/L鹽酸胍 , 200mmol/L2巰 基乙醇 。 室溫放置過夜 , 包含體裂解后應(yīng)澄清透 明 , 4 12000r/min 離心 15m in, 取上清液用預(yù)冷的復(fù) 性液 (20mmol/LTris 2HCl pH8. 5, 1mol/L鹽 酸 胍 , 0. 5mmol/L還原型谷胱苷肽 , 0. 5mmol/L氧化型谷胱苷 肽 , 0. 5mol/L精氨酸 , 2mmol/LEDT A , 80

11、mmol/LNaCl 在 4 透析復(fù)性 48h 。 (2 重組蛋白的純化 包含體復(fù)性后再以 B inding buffer (結(jié)合緩沖液、 300mmol/LNaCl , 50mmol/LNaH 2 PO 4, 10mmol/L咪唑 , pH 8. 0 充分透析 , 將 0. 45M 濾 膜過濾后的樣品溶液上樣至經(jīng)結(jié)合緩沖液平衡過的 N i 2NT A 親和層析柱 , 用 W ashing buffer (洗滌緩沖液、 300mmol/LNaCl , 50mmol/LNaH 2PO 4, 75mmol/L咪唑 , pH 8. 0 洗 滌 , 最 后 用 Eluting buffer (洗 脫

12、緩 沖 液、 300mmol/LNaCl , 50mmol/LNaH 2PO 4, 750mmol/L咪 唑 , pH 0 進(jìn)行洗脫 , 進(jìn)行 S DS 2 , 4 用蒸餾 , -20 保存 。2. 4 W estern 2blot 分析 樣品進(jìn)行 S DS 2PAGE 后 , 凝 膠置于轉(zhuǎn)移緩沖液 (24mmol/LTris 堿 , 192mmol/L甘氨 酸 , 20%甲 醇 中 漂 洗 , 采 用 B i o 2Rad SE M I 2DRY TRANSFER 轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行蛋白印跡轉(zhuǎn)移 , 根據(jù)凝膠面積 , 按 0. 65mA /cm 2, 2h, 經(jīng)電轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素 膜 , 轉(zhuǎn)

13、移畢用麗春紅 S 溶液 (0. 1%麗春紅 , 5%HAc 染 膜 , 以確定標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量條帶位置 。將膜置入雜交 袋 , 加入 含 5%脫 脂 牛 奶 的 T BS 緩 沖 液 (50mmol/L Tris 2HCl pH 6. 0, 150mmol/LNaCl , 4 封閉過夜 。 用 T BS 2T (含 0. 5%Triton X 2100的 T BS 洗膜 3次 , 加入抗 H is 2tag 的單克隆抗體 (用含 5%脫脂牛奶的 T BS 1 1000稀釋 , 室溫緩振 2h, T BS 2T 漂洗 3次 , 加入堿性磷 酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠多克隆抗體 (用含 5%脫脂牛 奶的

14、T BS 1 1000稀釋 , 室溫緩振 2h, T BS 2T 漂洗 3次 , 置于 NBT/BCIP 顯色液中顯色 , 室溫下避光輕搖 , 待條 帶清晰出現(xiàn)時(shí) , 將膜取出放入蒸餾水中終止顯色。 1. 2. 5 酪氨酸激酶活性測定 (EL I S A 法 7 在 96孔 板中包被酪氨酸激酶反應(yīng)底物 poly (Glu, Tyr 4 13. 7g/孔 , 37 包被過夜。 用 P BS 洗板 3次 , 晾干。 在 90l TK buffer (50mmol/LHepes pH7. 4, 12. 5mmol/LMgCl 2, 0. 0625mmol/LMnCl 2, 0. 2mmol/LNa

15、3VO 4 中加入終濃度 為 12. 5mol/L的 ATP, 再加入 5l EGFR 2TK, 于 37 孵 育 1h 進(jìn)行激酶反應(yīng)。 分別用 P BS 2T 和 P BS 各洗板 3次 , 晾干。每孔加入 250l 含 3%牛血清白蛋白 (BS A 的 P BS 溶液在室溫封閉 1h 。 分別用 P BS 2T 和 P BS 各洗板 3次 , 晾干。 每孔加入 100l 小鼠磷酸化酪氨酸的單克隆 抗體 (1 1000稀釋 , 室溫放置 2h 。 分別用 P BS 2T 和 P BS 各洗板 3次 , 晾干。每孔加入 100l 辣根過氧化物酶標(biāo) 記的山羊抗小鼠 I gG (H +L 多克隆抗

16、體 (1 1000稀釋 , 3 1中國生物工程雜志 China B i otechnol ogy Vol . 28No . 102008室溫放置 2h 。 分別用 P BS 2T 和 P BS 各洗板 3次 , 晾干。 每孔加入 T MB 和 H 2O 2各 50l, 室溫放置 1h, 加入 100l 1mol/LHCl 終止反應(yīng) , 使用酶標(biāo)比色計(jì) (B io 2Rad model 680 在 450nm 檢測樣品光密度值 (OD 。 基于上述方法 , 對不同濃度 EGFR 2TK 酶、 底物 poly(Glu, Tyr 4:1、 ATP 、 Mg 2+及 Mn 2+對酶催化底物磷酸化反應(yīng)的

17、影響進(jìn)行了研究 。1. 2. 6 酪氨酸激酶抑制劑篩選模型的構(gòu)建 根據(jù)上述酪氨酸激酶活性測定方法 , 構(gòu)建酪氨酸激酶抑制劑 篩選模 型 。除 了 EGFR 2TK 加 量 為 5 l 并 同 時(shí) 加 入 10l 待篩選的微生物發(fā)酵產(chǎn)物外 , 其他操作步驟同前 。 為檢驗(yàn)微生物發(fā)酵培養(yǎng)基是否干擾酶活性測定 , 加入 10l 空白發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)。 2 結(jié) 果2. 1 EGFR 2TK 從轉(zhuǎn)化子提取重組質(zhì)粒 pET 230a /EGFR2TK, 采用Kpn I 2H in d III 雙酶切該質(zhì)粒 , 獲得 946bp 的 DNA 片段 ,說明 EGFR 2TK 成功插入 pET 230a

18、載體中 (圖 1 。 通過 核苷酸測序結(jié)果顯示插入的 EGFR 2TK 與已知序列完 全一致 (GenBank Accessi on No . X00588。 圖 1 重組質(zhì)粒 pET30a /EGFR2TK 的酶切分析F i g . 1 Restr i cti on enzy m e ana lysis of reco m b i n an tpl a s m i d pET30a /EGFR2TK1:DNA Marker; 2:pET 230a /EGFR 2TK; 3:pET 230a /EGFR2TKdigested by Kpn I 2H in d III ; 4:pET 230a

19、/EGFR2TK digested by Kpn I ;5:pET 230a /EGFR2TK digested by H in d III2. 2 重組 EGFR 2TK 蛋白的表達(dá)及蛋白復(fù)性純化 采用不同濃度、 不同時(shí)間的 IPTG 對重組菌株 E.coli BL21pET 230a /EGFR 2TK 誘 導(dǎo) 表 達(dá) , 通 過 S DS 2PAGE 結(jié)果分析表明重組蛋白在 OD 600為 0. 61. 0, 0. 05mmol/LIPTG 誘 導(dǎo) 下 , 37培 養(yǎng) 5h 表 達(dá) 重 組 EGFR 2TK 最佳 。 S DS 2P AGE 分析超聲波破碎液的上清和沉淀 (圖2 , 結(jié)果

20、表明重組蛋白主要以包含體的形式存在 , 分子量約為 40kDa 與預(yù)期值相符。重組 EGFR 2TK 蛋白包 含體采用前述方法復(fù)性后 , 用 N i 2NT A 親和柱層析進(jìn)行 純化 , 結(jié)果如圖 3所示。2. 3 W estern 2blot 分析 采用抗 H is 2tag 的單克隆抗體對純化的重組 EGFR 2TK 進(jìn)行 W estern bl ot 雜 交 , 結(jié) 果 顯 示 重 組 蛋 白 在 約 40kDa 處出現(xiàn)單一雜交帶 , 這表明重組 EGFR 2TK 已在大腸桿菌表達(dá) , 因蛋白具有 H is 2tag 標(biāo)簽 , 因此能與抗H is 2tag 的單克隆抗體結(jié)合 (圖 4 。

21、41 2008, 28(10張 洋 等 :表皮生長因子受體酪氨酸激酶的克隆表達(dá)和酶抑制劑篩選模型的構(gòu)建 圖 4 重組 EGFR 2TK 蛋白的 W estern 印跡分析F i g. 4 W estern 2blotti n g ana lysis forreco m b i n an t EGFR 2TK1:Molecularweight marker; 2:E . coli BL21pET 230a /EGFR2TK2. 4 測定重組 EGFR 2TK 的酪氨酸激酶活性 對重組 EGFR 2TK 進(jìn)行酪氨酸激酶活性測定 , 結(jié)果 表明不同濃度的 EGFR 2TK 在 ATP 存在的條件下

22、, 能使 底物 poly (Glu, Tyr 4 1的酪氨酸發(fā)生磷酸化反應(yīng) , 其活 性呈劑量效應(yīng) , 當(dāng) EGFR 2TK 酶量達(dá)到 5l /孔時(shí)酪氨酸 激酶活性最高 (圖 5A , 然后曲線呈平直狀。 為了優(yōu)化重組 EGFR 2TK 酪氨酸激酶活性的測定條件、 分別 對 不 同濃 度 底 物 poly (Glu, Tyr 4 1、ATP 、 Mg 2+及 Mn 2+對酶活性影響進(jìn)行了研究 , 結(jié)果表明 poly (Glu, Tyr 4 1的最適濃度為 725g/孔 (圖 5B , ATP 12. 5C , Mg 2+的最佳濃度 2度 為 0. 0625mmol/L ( 圖 5 不同濃度激酶

23、 (A 、 多肽底物 (B 、 ATP(C 、 M g 2+濃度 (D和 Mn 2+(E 對重組 EGFR 2TK 激酶催化反應(yīng)的影響F i g . 5 Effects of concen tra ti on s of the enzy m e(A , ATP(B , poly (Glu, Tyr 4 1(C , M g2+(D andM n2+(E on the enzy ma ti c reacti on ca t a lyz i n g by the reco m b i n an t EGFR 2TK2. 5 EGFR 2TK 酶抑制劑篩選模型的構(gòu)建 利用上述方法構(gòu)建的 EGFR 2T

24、K 抑制劑篩選模型 , 已對 200余株微生物發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了篩選 , 根據(jù)抑制 率大于 50%確定陽性結(jié)果 , 目前篩選仍在進(jìn)行中 。同時(shí)結(jié)果還顯示微生物空白培養(yǎng)基對活性測定無干擾 。3 討 論 EGFR 是一種跨膜受體 , 存在至少 5種不同的配51 中國生物工程雜志 China B i otechnol ogy Vol . 28No . 102008基 , 其中包括 EGF 和 TGF 2, 在細(xì)胞生長調(diào)節(jié)和分化中 起重要作用 8。 70%以上生長的腫瘤細(xì)胞存在該受體 及其配基 , 其過度表達(dá)或調(diào)節(jié)障礙會(huì)改變胞內(nèi)信號(hào)途 徑 , 以不同方式影響腫瘤細(xì)胞的存活及凋亡 , 因此該受 體可作為腫瘤

25、治療的靶點(diǎn) 9, 以其為靶位國外已有 8種小分子抑制劑上市 10。 EGFR 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的羧基端含有主要的自磷酸化 位點(diǎn) 11, 當(dāng)其配基 EGF 、 TGF 2等與 EGFR 胞外域結(jié)合 后 , 胞內(nèi)的 EGFR 2TK 被激活 , 既可以使其羧基端的自 磷酸化位點(diǎn)磷酸化 , 同時(shí)也催化胞內(nèi)其他底物蛋白的 磷酸化 , 從 而 引起 信 號(hào)的 傳 導(dǎo) 。本研 究 在大 腸 桿菌 BL21中克隆表達(dá)了 EGFR 酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域 , 該部位 不存在自磷酸化位點(diǎn) , 因此表達(dá)的重組 2TK 磷酸化蛋白 ,但是在 ATP poly (Glu, Tyr 4 1, , 因 此可以用于構(gòu)建 EGFR 2T

26、K 抑制劑的篩選模型 。 研究表明獲得的重組 EGFR 2TK 存在 Mn 2+結(jié)合位 點(diǎn) ,Mn 2+可以通過使重組的 EGFR 2TK 蛋白構(gòu)象發(fā)生改 變而調(diào)節(jié)激酶的活性 12, 13,Mg 2+對 EGFR 2TK 催化活性 的影響較 Mn 2+弱 , 只有存在 EGF 等生長因子刺激的情 況下才能有效提高 EGFR 2TK 的活性 。因此本研究采 用不同濃度的 Mn 2+、 Mg 2+對 EGFR 2TK 的影響進(jìn)行了 分析 , 結(jié)果表明 0. 0625mmol /L的 Mn 2+即使酶催化活 性達(dá)最大值 , 而 Mg 2+所需濃度為 12. 5mmol/L,與文獻(xiàn) 分析結(jié)果一致 12

27、。 目前研究 EGFR 2TK 的抑制劑的主要途徑之一 , 是 作用于 EGFR 胞內(nèi)區(qū)干擾 ATP 結(jié)合的小分子化合物 。 在 EGFR 2TK 的 催 化 結(jié) 構(gòu) 域 中 存 在 ATP 的 結(jié) 合 位 點(diǎn) 14, 其抑制劑可以通過競爭性抑制 ATP 與 EGFR 2TK 的結(jié)合 , 從而阻止 EGFR 2TK 的激活和下游信號(hào)的傳 導(dǎo) 15。 基于以上機(jī)理 , 本文以重組 EGFR 酪氨酸激酶 為靶位 , 構(gòu)建了酶抑制劑篩選模型 , 擬從微生物產(chǎn)物中 篩選 EGFR 2TK 的抑制劑 。為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的有 效性 , 我們擬采用已知 EGFR 2TK 的抑制劑作為陽性對 照 , 目前尚

28、在尋求中。 與目前國內(nèi)外研究者主要采用 A431細(xì)胞 (人表 皮鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞 7、 sf916昆蟲細(xì)胞等真核細(xì)胞表 達(dá) EGFR 2TK 催化域的篩選模型相比較 , 以大腸桿菌表 達(dá)的 EGFR 2TK 構(gòu)建模型較方便易行。參考文獻(xiàn) 1Scagli otti G V, Selvaggi G, Novell o S, et al . The bi ol ogy ofep ider mal gr owth fact or recep t or in lung cancer . Clinical Cancer Research, 2004, 10:42274232 2Harari P M. Ep

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