堿性成纖維細胞因子在博萊霉素致肺纖維化肺血管損傷中的作用

1、堿性成纖維細胞因子在博萊霉素致肺纖維化肺血管損傷中的作用    作者：劉華，陳利萍，朱新菊，賀永鋒，趙杰，劉新社 【摘要】 目的 探討堿性成纖維細胞因子(bFGF)在博萊霉素(BLM)致大鼠肺纖維化肺組織中的表達及其在肺血管損傷中的作用。方法 于大鼠氣管內(nèi)注射BLM以復制其肺纖維化模型,應(yīng)用bFGF多克隆抗體按SABC法行免疫組織化學染色,定量圖像分析。結(jié)果 BLM組動物支氣管上皮細胞胞漿內(nèi)、支氣管和肺小動脈肌層以及肺泡巨噬細胞胞漿內(nèi)可見較多棕黃色細顆粒狀bFGF陽性表達產(chǎn)物,顯著高于對照組(P<0.05)。結(jié)論 在BLM致大鼠肺纖維化過程中bFG

2、F表達上調(diào)，提示bFGF可能參與肺間質(zhì)纖維化的發(fā)病過程。    【關(guān)鍵詞】 堿性成纖維細胞因子；博萊霉素；肺纖維化；血管損害；免疫組化 The role of bFGF in vascular injury ofBLM?induced pulmonary fibrosis ABSTRACT: Objective To explore the expression of basic fibroblast growth factor(bFGF) in pulmonary tissues of rats with bleomycin?induced pulmo

3、nary fibrosis and the role of bFGF in vascular injury. Methods Pulmonary fibrosis was induced in rats by intratracheal injection of bleomycin(BLM). Lung expression of bFGF proteins was assessed by SABC immunohistochemistry using bFGF monoclonal antibody and quantitative image analysis. Results The e

4、xpression of bFGF in the lung tissues of BLM group was mainly distributed in bronchiole epithelial cells, muscular layers of bronchi and arterioles, and alveolar macrophage. It was higher than that in control group, with significant difference (P<0.05). Conclusion The up?regulation expression of

5、bFGF in the BLM?induced pulmonary fibrosis indicates that it directly participates in the process of pulmonary fibrosis. KEY WORDS: basic fibroblast growth factor (bFGF); bleomycin; pulmonary fibrosis; vascular injury; immunohistochemical method 肺間質(zhì)纖維化是一種病因各異、表現(xiàn)相似的疾病譜，是各種彌漫型肺間質(zhì)疾病的最終表現(xiàn)形式，其主要病理特點是肺內(nèi)成纖

6、維細胞過度增殖和細胞外基質(zhì)的過多聚集。肺間質(zhì)纖維化一旦形成，將不可逆地導致嚴重的甚至致命的呼吸循環(huán)功能障礙。有關(guān)肺纖維化發(fā)生的機理已有了較為深入的研究，但纖維化過程中肺組織、血管的損傷機制尚不清楚。堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)具有強大的促進細胞分裂增殖的作用1，是各種原因所致肺間質(zhì)纖維化形成機制研究的重點對象。在本研究中，我們應(yīng)用免疫組織化學技術(shù)結(jié)合圖像分析，觀察博萊霉素(bleomycin, BLM)致大鼠肺組織纖維化中肺組織bFGF的表達，從血管損傷方面探討bFGF在BLM致肺間質(zhì)纖維化的發(fā)病機制中的作用。 1 材料與方

7、法 1.1 實驗動物及分組 體重200-250g的健康雌性Wistar大鼠60只，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。隨機分為BLM組和生理鹽水對照組，每組30只。 1.2 肺纖維化模型的建立 BLM組用戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，在無菌操作下作頸部正中切口，逐層暴露氣管，用lmL注射器(前帶7號針頭)抽取含BLM(5mg/kg)的生理鹽水0.2-0.3mL，經(jīng)兩氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端刺入氣管。將大鼠直立，繼續(xù)朝向心端進針約1.0-1.5cm，回抽出空氣并無阻力后，將藥液注入氣管，旋轉(zhuǎn)動物，使藥液在肺內(nèi)分布充分、均勻。縫合傷口。對照組，在同樣條件下，向氣管內(nèi)注入相同體積的生

8、理鹽水。兩組動物分別于氣管內(nèi)灌注后3、7、14、21、28d隨機處死動物各6只。 1.3 肺組織病理標本的制作 戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。常規(guī)消毒后開胸，暴露心肺，于右心室插入與輸液器相連的針頭，左心耳剪一約2mm左右切口，向右心室內(nèi)灌注PBS(pH 7.4)沖洗血管至雙肺呈白色膠凍狀。結(jié)扎左主支氣管，經(jīng)氣管向右肺注入40g/L多聚甲醛6mL，使胸膜展開，結(jié)扎氣管后右肺置40g/L多聚甲醛中固定。上、中、下葉各取材一塊，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片(5m)。 1.4 bFGF免疫組織化學染色 采用免疫組化SABC法，bFGF多克隆抗體購自博士德公司。免疫組織化學染色按試劑盒說明

9、書進行：石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水；3%(體積分數(shù))H2O2(蒸餾水新鮮配制)室溫5min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗，3min×3；復合消化液1min，蒸餾水洗，3min×3；正常工作血清封閉液室溫10min，甩去多余液體，不洗；兔抗大鼠bFGF多克隆抗體(IgG型)，經(jīng)預(yù)試驗選擇工作濃度為1100，4過夜，0.01mol/L PBS洗，3min×3；生物素化山羊抗兔IgG抗體，37 20min，0.01mol/L PBS洗，3min×3。SABC試劑37 20min，0.01mol/L PBS洗，5min×4；DBA室溫顯色，蒸餾水洗；蘇木素復染，

10、脫水、透明、封片。各組均設(shè)陰性對照切片，以0.01mol/L PBS代替一抗。 1.5 bFGF的定量分析 使用北京航空彩色病理圖像分析系統(tǒng)。將待測切片放置在連接計算機的顯微鏡下觀察。每組6只動物，每只動物取3張組織切片,每張切片取5個視野(上、中、下、左、右)，于高倍鏡下(×400)檢測bFGF平均吸光度值(A)。 1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計分析軟件，各組間進行t檢驗和相關(guān)分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。 2 結(jié)果 2.1 肺組織的病理變化 大體標本：對照組雙肺呈粉紅色，表面光滑,開胸后迅速萎陷；BLM組可見雙肺表面灶狀分布的出血點，隨時間延長上述改變由

11、新鮮變?yōu)殛惻f，肺表面可見點狀、索條狀淡黃色凹陷，開胸后肺組織萎陷不明顯。組織學觀察：NS組各觀察點均無明顯改變。BLM組第3天可見肺泡壁水腫，炎性細胞滲出增多；第7天炎癥更明顯，為大片狀炎性細胞浸潤，成纖維細胞增多；第14天時肺泡炎仍較重，成纖維細胞進一步增多；第21-28天部分肺泡結(jié)構(gòu)消失，局灶性纖維化和纖維結(jié)節(jié)形成，炎性細胞滲出有所減少。    2.2 bFGF在肺組織內(nèi)的分布 各組大鼠肺組織bFGF多克隆抗體免疫組化染色陽性表達產(chǎn)物為棕黃色細顆粒狀。兩組動物的空白對照切片均未見陽性表達。NS組大鼠肺組織切片內(nèi)見bFGF弱陽性表達,主要分布于支氣管上

12、皮細胞胞漿內(nèi),支氣管和肺小動脈的肌層也有弱陽性表達(圖1)。BLM組動物上述部位bFGF的陽性表達明顯增強,支氣管上皮細胞胞漿內(nèi)、支氣管和肺小動脈的肌層以及肺泡巨噬細胞胞漿內(nèi)均可見較多棕黃色顆粒狀強陽性表達產(chǎn)物(圖2)。    圖1 NS組肺組織中的bFGF的弱陽性表達（略） Fig.1 The weak positive staining of bFGF in control groupSABC ×200 圖2 BLM組肺組織中bFGF的陽性表達（略） Fig.2 The positive staining of bFGF in Bleomy

13、cin group SABC ×200 2.3 bFGF表達的定量檢測 定量分析結(jié)果顯示，支氣管上皮細胞、肺血管的肌層以及肺泡巨噬細胞胞漿內(nèi)bFGF的表達于氣管內(nèi)灌注BLM后第7天即開始增高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，第28天時仍高于對照組 (P<0.05，表1)。 表1 對照組與BLM組bFGF表達水平的對比（略） Table 1 The expression level of bFGF in control and Bleomycin groups *P<0.05 vs. control group 3 討論 肺纖維化是以肺內(nèi)成纖維細胞過度增

14、殖和細胞外基質(zhì)的過多聚集,導致肺順應(yīng)性降低、容量減少，最終引起呼吸衰竭為特征的一組慢性病變。在肺纖維化過程中，隨著肺組織損傷的發(fā)生，必然啟動組織修復的一系復雜的調(diào)節(jié)過程，其中血管的修復和新生起著重要作用。研究表明，許多在血管新生中起重要作用的細胞因子在纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中同樣起著關(guān)鍵作用2?3。以往的研究資料表明在特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化、結(jié)節(jié)病、鈹塵肺、氧中毒等多種疾病中均可見肺組織的bFGF表達上調(diào)，可能參與了其肺間質(zhì)纖維化的發(fā)病過程4。成纖維細胞生長因子(FGF)是一種結(jié)構(gòu)相關(guān)的多肽生長因子家族，具有很強的促細胞生長作用，能影響多種細胞的生長、分化及功能。根據(jù)其等電點的不同，F(xiàn)GF分為酸性成

15、纖維細胞生長因子(aFGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)。資料表明，bFGF有很強的促血管壁細胞增生的作用，在體內(nèi)和體外均能明顯促進新生血管形成。將含有bFGF的海綿植入大鼠的皮下或腹腔,確認有強有力的血管新生作用5。bFGF在慢性阻塞性肺疾病氣道重構(gòu)和肺小動脈重建中也起著重要作用6。病理學研究表明，BLM誘導的肺纖維化早期變化以肺泡炎為主要特征7?8。肺泡炎又與血管損傷有密切關(guān)系，BLM作用后第3天電鏡下即可觀察到肺泡壁基底膜水腫、裸露、斷裂，血管內(nèi)皮細胞受損9。在本實驗中，BLM作用后第3天即見炎癥細胞滲出增多，至第7天炎癥更加明顯。伴隨血管內(nèi)皮的損傷，必然啟動一系列的血管修復機制

16、。實驗表明，外源性bFGF對受損血管的內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞有促有絲分裂作用。bFGF對新生血管形成過程中多個環(huán)節(jié)均有促進作用，可趨化血管內(nèi)膜的各類細胞，并誘導這些細胞表達組織重建所需的血漿酶原激活劑、膠原酶、蛋白水解酶等。這些酶類通過促使血管內(nèi)皮基膜降解和刺激內(nèi)膜各類細胞的增值與遷移，誘導血管內(nèi)皮細胞長入膠原基質(zhì)中形成管腔，并促進神經(jīng)元與新生血管共同生長。本組實驗結(jié)果顯示,各組空白對照均無bFGF表達；對照組肺組織中bFGF呈低水平表達，主要表達于大氣道壁和血管壁的平滑肌細胞；BLM組在博萊霉素給藥后7d，bFGF表達提高，至給藥后28d，仍有較高水平的表達。BLM給藥后7d，組織炎癥最為明顯

17、，導致血管內(nèi)皮損傷啟動血管修復機制，bFGF作為重要的血管活性物質(zhì),它的表達增高，作用于受損血管的內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞，促進血管新生。bFGF對成纖維細胞亦具有強烈的趨化和增生刺激作用，這說明bFGF在在肺纖維化過程中具有重要作用。本研究通過對bFGF表達水平的檢測，從血管損傷方面進一步闡述了肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生機制，為探討肺纖維化的治療提供了新方向。 基金項目：陜西省自然科學基金資助項目(No.2003C238) 【參考文獻】 1Inoue Y, King TE, Tinkle SS, et al. Human mast cell basic fibroblast growth factor

18、in pulmonary fibrotic disorders J. Am J Pathol, 1996, 149(6):2037?2954.2Mikulec AA, Hanasono MM, Lum J, et al. Effect of tamoxifen on transforming growth factor beta1 production by keloid and fetal fibroblasts J. Arch Facial Plas Surg, 2001, 3(2):111?114.3Jacobs TW, Schnitt SJ, Tan X, et al. Radial scars of the breast and breast carcinomas have similar alterations in expression of factors involved in vascular stroma formation J. Hum Pathol, 2002, 33(1):29?38.4Sa