梗阻性黃疸大鼠中性粒細胞凋亡的實驗研究

1、梗阻性黃疸大鼠中性粒細胞凋亡的實驗研究 作者：高海斌 陳斌 倪勇 鄧雪松 王成友 張敏杰【摘要】 目的：探討梗阻性黃疸大鼠外周血中性粒細胞凋亡的改變。方法：將 66 只成年 Wistar 大鼠隨機分為正常（A） 組、假手術（B）組和膽總管結扎（CBDL, C）組，B、C 組術后又分為 1、3、7、10、14 d 5 個時相點；應用流式細胞儀檢測中性粒細胞（PMN）的凋亡指數(shù)（AI），通過 ELISA 雙抗體夾心法測定血清 IL-8。結果：C 組大鼠術后各時相點 PMN的 AI 顯著降低，與 A 組和 B 組均有顯著差異（P 0.05）；C 組大鼠術后各時相點血清 IL-8 水平顯著升高，與 A

2、 組和 B 組均有顯著差異（P 0.05）；且血清 IL-8 水平與 PMN 的 AI 的改變有顯著負相關性。結論：梗阻性黃疸大鼠外周血 PMN 的 AI 明顯降低，且與 IL-8 水平異常升高有關，在梗阻性黃疸過度炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展中有著重要意義。 【關鍵詞】 膽道梗阻；中性粒細胞；凋亡；細胞因子；IL-8 AbstractObjective To investigate the changes of apoptosis of peripheral polymorphonuclear neutrophil(PMN) in the rats with obstructive jaundice

3、. Methods 66 Wistar adult rats were randomly divided into three groups: normal group (group A), sham operation group (group B) and common bile duct ligation group (CBDL, group C), and each group were randomly divided to subgroups of day 1, 3, 7, 10, 14 again. The flow cytometry was used to detect an

4、d evaluate the change of apoptosis in vitro after PMN were harvested from the rats. IL-8 was detected ELISA method. Results Apoptosis index (AI) of PMN in group C was lower than in groups A and B at 1, 3, 7, 10, 14 days after CBDL; The level of IL-8 in serum in group C was higher than in groups A an

5、d B at 1, 3, 7, 10, 14 days after CBDL. Moreover, there was a marked negative correlation between AI and level of IL-8. Conclusion The apoptotic PMN is decreased, which is intimately associated with the level of IL-8, which may induce excessive inflammation, and play a crucial role in the initiation

6、 and development of obstructive jaundice. Key Words Obstructive jaundice; Polymorphonuclear neutrophil; Apoptosis; Cytokine; IL-8 中性粒細胞（Polymorphonuclear neutrophil, PMN）是機體非特異防御反應的重要執(zhí)行者，在炎癥反應中扮演重要角色，在有效地發(fā)揮防御功能，避免炎癥的加強、擴散和遷移的方面具有重要作用1。我們之前的研究表明，梗阻性黃疸大鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力異常，不能及時清除凋亡的 PMN，導致機體免疫功能障礙，但有關 PMN 凋亡

7、功能改變的研究卻鮮有報道。為此，在此基礎上，我們應用流式細胞術檢測大鼠梗阻性黃疸后外周血 PMN 凋亡的改變并試探討其意義及發(fā)生機制。 1 材料與方法 1.1 實驗動物分組及模型制備 健康成年 Wistar 大鼠 66 只（第一軍醫(yī)大學動物中心），雌雄各半，體重 220280 g，隨機分為 3 組：正常對照（A）組（n = 6），定為 0 時相；假手術對照（B）組（n = 30），分術后 1、3、7、10、14 d 5 個時相點，每個時相點 6 只；膽總管結扎（C）組（CBDL，n = 30），分為術后 1、3、7、10、14 d 5 個時相點，每個時相點 6 只。 CBDL 模型制備：乙醚吸

8、入麻醉，上腹正中切口進腹，近十二指腸雙重結扎膽總管，并于兩結扎線之間切斷。B 組除不結扎和切斷膽總管外，其余同上；A 組不作任何處理。術后實驗大鼠自由飲水進食，于術后相應時相點處死。 1.2 主要試劑與儀器 流式細胞儀（Beckman Coulter 公司 XL 型），Annexin-V-FITC 試劑盒購于 Bender 公司，RPMI 1640 培養(yǎng)基購于 Gibco 生物技術公司，中性粒細胞分離液購于上海華精生物科技有限公司。 1.3 中性粒細胞的分離與純化 取肝素抗凝靜脈血樣，于室溫下靜置 1 h 或離心 2 000 r/min、15 min，然后吸取富含白細胞的“白膜層”。然后應用

9、Ficoll （聚蔗糖）- Hypaque（泛影葡胺）密度梯度離心法 行中性粒細胞的分離與純化，最后臺盼藍染色法檢查 PMN 活力 98%，瑞氏染色法檢查 PMN 純度 95%。 1.4 PMN 凋亡指數(shù)檢測 取純化 PMN，調整細胞濃度為 1106/mL，加入 5 L Annexin-V 和 10 L 碘化丙錠（PI），室溫避光 15 min。然后加入0.4 mL 1Binding 緩沖液上流式細胞儀檢測。采用Annexin-V 和 PI 雙標法，雙通道檢測 5 000 個細胞，激發(fā)光波長 488 nm，發(fā)射光波長 515、560 nm。Annexin-V + / PI - 的為凋亡細胞，A

10、nnexin-V + / PI + 的為壞死細胞，Annexin2V - / PI - 的為活細胞，計數(shù)凋亡細胞占的百分比作為凋亡指數(shù)。 1.5 血清 IL-8 檢測 嚴格按試劑盒說明書要求操作，根據(jù)標準品得出的 A（OD）值繪制標準曲線，計算出樣本中 IL-8 的濃度。 1.6 統(tǒng)計學方法 實驗結果以 xs 表達，采用方差分析；t 檢驗；直線相關分析。 2 結 果 2.1 外周血 WBC 及 PMN 的數(shù)量變化 隨著膽道梗阻時間的延長，C 組外周血 WBC 數(shù)目不斷增加，且以 PMN 升高為主，呈明顯的時間依賴性改變。B 組 WBC 和 PMN 在術后變化不大。C 組各時相點 WBC 和 P

11、MN 均明顯高于 A 組及 B 組相應時相點。 2.2 外周血 PMN 的凋亡指數(shù)和血清 IL-8 水平 見表 1 和表 2。C 組中各時相的凋亡指數(shù)與 B 組同一時相點和 A 組相比較差異均有統(tǒng)計學意義（均為 P 0.05）。C 組血清 IL-8 各時相水平與 B 組同一時相點和 A 組相比較差異均有統(tǒng)計學意義（P 0.05）。 2.3 相關性分析 通過對 C 組血清 IL-8 水平與 PMN 的凋亡指數(shù)進行相關分析（r = -0.909，P 0.0001），表明 IL-8 水平與凋亡率存在顯著負相關性。 3 討 論 PMN 作為機體非特異防御反應的重要執(zhí)行者，它以凋亡的方式死亡，并被巨噬細

12、胞識別、吞噬而清除，對維持內環(huán)境的穩(wěn)定和促使已發(fā)生炎癥的局限及消退具有重要意義1。因此，凋亡被認為是機體清除具有潛在損害活性的 PMN 有效的生理調節(jié)機制。當 PMN 凋亡減少或延遲，大量滯留于機體組織，過度、持續(xù)地活化并產(chǎn)生大量的活性氧自由基和多種蛋白水解酶，加重炎癥反應和組織損傷，甚至引發(fā)全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙綜合征4，5。 梗阻性黃疸后圍手術期易并發(fā)感染和敗血癥與機體免疫功能的紊亂，與炎性細胞機能的改變有明顯的關系。本實驗結果顯示，隨著膽道梗阻的形成和時間的延長，BDL 大鼠外周血的 WBC 數(shù)量不斷上升，尤其以 PMN 升高為主，呈現(xiàn)時間依賴性變化。并且，CBDL 大鼠術后

13、 1 d PMN 開始凋亡，且隨著病程的延長逐漸降低。這說明 CBDL 大鼠的 PMN 不僅存在數(shù)量增加，而且凋亡貫穿于梗阻性黃疸的始終，這必將在梗阻性黃疸感染和膿毒血癥的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用。 IL-8 是機體內一種重要的細胞因子，其主要靶細胞是 PMN，對 PMN 起特異性的趨化和活化作用，并可誘導它進入炎癥部位，促進變形、脫顆粒、釋放溶酶體酶、產(chǎn)生超氧化物，并延長存活時間和增強活性功能。本實驗結果顯示，CBDL 大鼠術后血清 IL-8 水平逐漸升高，且與 PMN 的凋亡指數(shù)的變化呈現(xiàn)負相關。我們認為，IL-8 異常升高可能是引起 PMN 凋亡延遲的原因之一，導致持續(xù)、過度的炎癥

14、反應和組織損傷。而 IL-8 參與細胞凋亡調節(jié)的具體機制目前尚未明確。 總之，CBDL 大鼠存在 PMN 凋亡的延遲，與細胞因子 IL-8 水平的升高密切相關。深入了解外周血 PMN 凋亡變化的意義，有利于揭示梗阻性黃疸易發(fā)感染和膿毒血癥的機理，為臨床治療提供可靠的理論依據(jù)?！緟⒖嘉墨I】 1Chilvers ER, Cadwallader KA, Reed RJ, et al. The function and fate of neutrophils at the inflamed site: prospects for therapeutics interventionJ. JR Coll

15、Physicians Lond, 2000, 34(1):68-74 2倪勇, 高海斌, 劉琰, 等. 梗阻性黃疸大鼠腹腔巨噬細胞凋亡和吞噬功能的改變J. 中華實驗外科雜志, 2004, 21(12): 1425-14273劉文超, 劉智廣, 張曉楠, 等. 外周血中性粒細胞的分離方法J. 細胞與分子免疫學雜志, 1996, 12(4):64-664Diebel LN, Liberati DM, Taub JS, et al. Intestinal epithelial cells modulate PMN activation and apoptosis following bacterial and hypoxic challengesJ. J Trauma, 2005, 58(6): 1126-11335Lea F, Luciano FF, Mary CB, et al. Neutrophil apoptosis: a marker of disease severity in sepsis and sepsis-induced acute respiratory distress syndromeJ. Crit C