表達譜基因芯片篩選前體脂肪細胞分化相關基因的研究

1、表達譜基因芯片篩選前體脂肪細胞分化相關基因的研究         10-02-03 09:42:00     作者：桂樂 郭新 吳翔    編輯：studa20【摘要】  目的:運用基因芯片技術研究前體脂肪細胞分化相關基因表達譜的變化。方法: 體外培養(yǎng)前體脂肪細胞（3T3-L1），誘導分化為成熟脂肪細胞。提取脂肪細胞總RNA , 純化mRNA 后逆轉錄制備目標序列, 應用含有45038 種小鼠基因cDNA 的表達譜芯片Mous

2、e430_2進行差異表達譜分析。結果: 在前體脂肪細胞分化的基因表達譜中差異表達基因共有640 條,其中表達水平顯著變化的有38條（表達水平改變5倍以上），上調基因24 條,下調基因14 條。差異表達基因中有細胞凋亡相關基因、原癌基因和抑癌基因、細胞信號和傳遞蛋白基因等多種基因。這些基因可能與脂肪細胞分化相關疾病的發(fā)病機制有關。結論:采用基因芯片技術篩選脂肪細胞分化相關基因,可能為脂肪細胞分化相關疾病病因和發(fā)病機制的研究提供新思路。 【關鍵詞】  前體脂肪細胞；基因表達；基因芯片    Abstract   Objective: To

3、 screen the differently expressed genes during cell  differentiated of adipocyte 3T3-L1 using cDNA microarray. Methods: 3T3-L1 cells were cultured, induce them differentiated, isolate total RNA. Reversely transcripted to cDNAs with fluorescent dUTP to prepare the target sequences , then the tar

4、get sequences were hybridized to cDNA microarray of 45038 human genes. After washing , the cDNA microarray were scanned for the fluorescent signals and showed differences between 2 kinds of cells. Results: Among 45038 geneprobes , the expression level of 640 genes changed, 38 genes showed dramatical

5、ly differential expressed profile with 24 upregulated and 14 downregulated genes. The differential expressed genes were related with apoptosis , proto or antioncogene , cell signal conduct , and ytoskeleton , etc. These genes might be related with the pathogenesis of adipocyte differentiation. Concl

6、usion: The investigations based on cDNA microarray can sequence related genes in adipocyte differentiation , and may provide a new idea in studying pathogenesis of adipocyte differentiation.    Key words   3T3-L1 cell ; Gene expression ; cDNA microarray    脂肪組

7、織不僅是被動的能量儲存器官，而且是能夠分泌多種激素類物質的內分泌器官；人類多種疾病與脂肪細胞分化及其調控失常有關，包括肥胖癥、脂肪肝、高脂血癥、糖尿病及乳腺癌等疾病1。研究脂肪細胞分化機制及其調控，不僅對研究上述生理和疾病過程機制有重要理論意義，而且對其預防與治療也具有實際意義。為此, 我們應用基因芯片技術研究3T3-L1細胞分化前后基因表達譜的改變, 全面了解3T3-L1細胞分化所伴發(fā)的基因差異表達, 研究3T3-L1細胞分化的產生機制并為尋找相應的干預手段提供理論基礎。    1   材料與方法    1.1&

8、#160;  材料   3T3-L1細胞由本實驗室保存，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶和TRIzol由美國Invitrogen公司提供，胰島素、地塞米松、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(MIX)和油紅O(oil red-O)染料由美國Sigma公司提供，One-Cycle cDNA Synthesis Kit、 IVT Labelling Kit、Hybridization,wash and stain Kit、Mouse430_2基因芯片由美國AFFYMETRIX公司提供。    1.

9、2   方法     10-02-03 09:42:00     作者：桂樂 郭新 吳翔    編輯：studa20    2   結      果    2.1   細胞染色結果   誘導分化前，3T3-L1前體脂肪細胞呈梭形，細胞質內未見亮紅色顆粒；誘導分化后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細

10、胞逐漸由梭形變?yōu)閳A形，胞體變大變圓，細胞質內被油紅O染成亮紅色的脂滴逐漸增多增大，第10天時，可見含有亮紅色脂滴的成熟脂肪細胞在視野中占95%以上。    2.2   3T3-L1細胞分化前后的顯著差異表達基因   3T3-L1細胞分化前后中顯著差異表達基因共有38 條,其中上調基因為24條,下調基因為14條。在差異表達基因中有細胞凋亡基因、原癌基因和抑癌基因、細胞骨架和運動蛋白相關基因、細胞信號和傳遞蛋白基因等多種基因參與。    3   討  

11、0;   論    本研究通過3T3-L1前體脂肪細胞體外培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，3T3-L1前體脂肪細胞的分化過程中，相關基因表達水平有顯著變化。由此推測，這些基因參與了脂肪細胞的分化過程。    基因芯片技術是一種新的基因表達研究方法2，3，它利用核酸雜交的原理，在固體支持物上一次檢測成百上千乃至上萬種基因的表達水平，具有傳統(tǒng)方法無可比擬的高通量特點，達到了一定意義上的全基因表達譜的檢測。因此，基因芯片技術為了解生命復雜體系提供了技術平臺4。我們采用基因芯片技術篩選脂肪細胞分化中的差異表達基因,試圖初步揭示其發(fā)生機制。結

12、果表明:總計發(fā)現(xiàn)38 條顯著差異表達基因。其中有炎性反應、免疫應答、免疫調控、細胞增殖、凋亡、細胞骨架運動、細胞信號和傳遞蛋白等多種基因參與，這些均證實脂肪細胞分化的發(fā)生是多基因參與的過程。【參考文獻】  1 Grun F, Blumbeg B. Environment obesogens: Organotins andendocrine disruption via nuclear receptor signalingJ. Endocrinol.2006，147（Suppl）:S50-S55.2 Page GP, Zakharkin SO, Kim K, et al. Microa

13、rray analysisJ. Methods Mol Biol, 2007,404:409-430.3 Barla A, Jurman G, Riccadonna S, et al. Machine learning methods for predictive proteomicsJ. Brief Bioinform, 2008， 9(2):119-128.4 Wang Y, Miller DJ, Clarke R. Approaches to working in high-dimensional data spaces: gene expression microarraysJ. Br

14、 J Cancer, 2008,98(6):1023-1028.     10-02-03 09:42:00     作者：桂樂 郭新 吳翔    編輯：studa20    2   結      果    2.1   細胞染色結果   誘導分化前，3T3-L1前體脂肪細胞呈梭形，細胞質內未見亮紅色顆粒；誘導

15、分化后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細胞逐漸由梭形變?yōu)閳A形，胞體變大變圓，細胞質內被油紅O染成亮紅色的脂滴逐漸增多增大，第10天時，可見含有亮紅色脂滴的成熟脂肪細胞在視野中占95%以上。    2.2   3T3-L1細胞分化前后的顯著差異表達基因   3T3-L1細胞分化前后中顯著差異表達基因共有38 條,其中上調基因為24條,下調基因為14條。在差異表達基因中有細胞凋亡基因、原癌基因和抑癌基因、細胞骨架和運動蛋白相關基因、細胞信號和傳遞蛋白基因等多種基因參與。    3   討

16、      論    本研究通過3T3-L1前體脂肪細胞體外培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，3T3-L1前體脂肪細胞的分化過程中，相關基因表達水平有顯著變化。由此推測，這些基因參與了脂肪細胞的分化過程。    基因芯片技術是一種新的基因表達研究方法2，3，它利用核酸雜交的原理，在固體支持物上一次檢測成百上千乃至上萬種基因的表達水平，具有傳統(tǒng)方法無可比擬的高通量特點，達到了一定意義上的全基因表達譜的檢測。因此，基因芯片技術為了解生命復雜體系提供了技術平臺4。我們采用基因芯片技術篩選脂肪細胞分化中的差異表達

17、基因,試圖初步揭示其發(fā)生機制。結果表明:總計發(fā)現(xiàn)38 條顯著差異表達基因。其中有炎性反應、免疫應答、免疫調控、細胞增殖、凋亡、細胞骨架運動、細胞信號和傳遞蛋白等多種基因參與，這些均證實脂肪細胞分化的發(fā)生是多基因參與的過程?！緟⒖嘉墨I】  1 Grun F, Blumbeg B. Environment obesogens: Organotins andendocrine disruption via nuclear receptor signalingJ. Endocrinol.2006，147（Suppl）:S50-S55.2 Page GP, Zakharkin SO, Kim K, et al. Microarray analysisJ. Methods Mol Biol, 2007,404:409-430.3 Barla A