研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的主要方法

1、研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的主要方法吳乃虎教授1，黃美娟教授2（1.中國科學(xué)院研究生院；1.中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所；2.北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院）一、引言 在許多的細胞生命活動中，例如DNA復(fù)制、mRNA轉(zhuǎn)錄與修飾以及病毒的感染等都涉及到DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用的問題。重組DNA技術(shù)的發(fā)展，人們已分離到了許多重要的基因?，F(xiàn)在的關(guān)鍵問題是需要揭示環(huán)境因子及發(fā)育信號究竟是如何控制基因的轉(zhuǎn)錄活性。為此需要：a、鑒定分析參與基因表達調(diào)控的DNA元件；b、分離并鑒定這些順式元件特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)因子；這些問題的研究都涉及到DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的實驗方法主要包

2、括：a、凝膠阻滯實驗； b、DNase 1 足跡實驗；c、甲基化干擾實驗； d、體內(nèi)足跡實驗； f、拉下實驗。二、凝膠阻滯實驗1、概念： 凝膠阻滯實驗（Gel retardation assay），要叫做DNA遷移率變動試驗（DNA mobility shift assay）或條帶阻滯實驗（Band retardation assay）是在八十年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。2、原理： 在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA分子向正電極移動距離的大小是同其分子量的對數(shù)成反比。如果某種DNA分子結(jié)合上一種特殊的蛋白質(zhì)，那么由于分子量的加大它在凝膠中

3、的遷移作用便會受到阻滯，于是朝正極移動的距離也就相應(yīng)的縮短，因而在凝膠中出現(xiàn)滯后的條帶，這就是凝膠阻滯實驗的基本原理。3、過程: 首先制備細胞蛋白質(zhì)提取物（理論上其中含有某種特殊的轉(zhuǎn)錄因子） 用放射性同位素標記待檢測的DNA片段（含有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點） 這種被標記的探針DNA同細胞蛋白質(zhì)提取物一起進行溫育，于是產(chǎn)生DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物在控制使DNA-蛋白質(zhì)保持結(jié)合狀態(tài)的條件下，進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳最后進行放射自顯影，分析電泳結(jié)果4、實驗結(jié)果的分析： a、如果有放射性標記的條帶都集中于凝膠的底部，這就表明在細胞提取物中不存在可以同探針DNA相互結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)；b、如果在凝膠的頂部

4、出現(xiàn)放射性標記的條帶，這就表明細胞提取物存在可與探針DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)。5、DNA競爭實驗：DNA競爭實驗（DNA competitive assay）的具體做法如下：在DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合的反應(yīng)體系中加入了超量的非標記的競爭DNA（competitor DNA），如果它同探針DNA結(jié)合的是同一種轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)，那么由于競爭DNA與探針DNA相比是極大超量的，這樣絕大部分轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)都會被競爭結(jié)合掉，而使探針DNA仍然處于自由的非結(jié)合狀態(tài)，可以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上就不會出現(xiàn)阻滯的條帶；如果反應(yīng)體系中加入的競爭DNA并不能同探針DNA競爭結(jié)合同一種轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果在電泳凝膠中的放射

5、自顯影圖片上就會出現(xiàn)阻滯的條帶。6、應(yīng)用： a、凝膠阻滯實驗可以用于鑒定在特殊類型細胞蛋白質(zhì)提取物中，是否存在能同某一特定的DNA（含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點）結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)； b、DNA競爭實驗可以用來檢測轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)同DNA結(jié)合的精確序列部位； c、通過競爭DNA中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的堿基突變可以研究此種突變競爭性能及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合作用的影響； d、也可以利用DNA同特定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合作用通過親和層析來分離特定的轉(zhuǎn)錄因子。三、足跡實驗1、定義:足跡實驗（foot-printing assay），是一種用來檢測被特定轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的DNA序列的位置及其核苷酸序列結(jié)構(gòu)的專門實驗方法。

6、2、原理： 當DNA分子中的某一區(qū)段同特異的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合之后便可以得到保護而免受DNaseI 酶的切割作用，而不會產(chǎn)生出相應(yīng)的切割分子，結(jié)果在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現(xiàn)了一個空白區(qū)，俗稱為“足跡”。3過程： 將待檢測的雙鏈DNA分子在體外用32P作5末端標記，并用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切出其中的一個末端，于是便得到了一條單鏈末端標記的雙鏈DNA在體外同細胞蛋白質(zhì)提取物（細胞核提取物也可以）混合，形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體在反應(yīng)混合物中加入少量的DNase I,并控制用量使之達到平均每條DNA鏈，只發(fā)生一次磷酸二酯鍵的斷裂：a、如果蛋白質(zhì)提取物中不存在與DNA結(jié)合的特定蛋白質(zhì)，使DNase I消

7、化之后，便會產(chǎn)生出距離放射性標記末端1個核苷酸，2個核苷酸，3個核苷酸-等等一系列前后長度均相差一個核苷酸的不間斷的連續(xù)的DNA片段梯度群體；b、如果DNA分子同蛋白質(zhì)提取物中的某種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，被結(jié)合部位的DNA就可以得到保護免受DNase I酶的降解作用；除去蛋白，加樣在20%序列膠上進行電泳分離，實驗分兩組:a、實驗組：DNA+蛋白質(zhì)混合物b、對照組：只有DNA，未與蛋白質(zhì)提取物進行溫育最后進行放射性自顯影，分析實驗結(jié)果。4、結(jié)果判斷:實驗組凝膠電泳顯示的序列，出現(xiàn)空白的區(qū)域表明是轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合部；與對照組序列比較，便可以得出蛋白質(zhì)結(jié)合部位的DNA區(qū)段相應(yīng)的核苷酸序列。5、其他的足跡

8、實驗方法：除了DNase1足跡試驗之外，目前還發(fā)展出了若干種其他類型的足跡實驗，例如：a、 自由羥基足跡實驗；b、菲咯啉銅足跡實驗；c、DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗的原理DMS能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學(xué)切割。如果DNA分子中某一區(qū)段同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，就可以避免發(fā)生G殘基的甲基化而免受六氫吡啶的切割作用。四、甲基化干擾實驗1、概念：甲基化干擾實驗（Methylation interference assay）是根據(jù)DMS（硫酸二甲酯）能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化，而六氫吡啶又會對甲基化的

9、G殘基作特異性的化學(xué)切割這一原理設(shè)計的另一種研究蛋白質(zhì)同DNA相互作用的實驗方法。應(yīng)用這種技術(shù)可以檢測靶DNA中G殘基的優(yōu)先甲基化，對爾后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用究竟會有什么效應(yīng)，從而更加詳細的揭示出DNA與蛋白質(zhì)相互作用的模式。2、實驗步驟： 用DMS處理靶DNA使之局部甲基化（平均每條DNA只發(fā)生一個G堿基甲基化作用） 同細胞蛋白質(zhì)提取物一起進行溫育，促進使DNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合 進行凝膠電泳形成兩種靶DNA條帶：a、 其一沒有同蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA正常電泳條帶b、其二同特異蛋白質(zhì)結(jié)合而呈現(xiàn)滯后的DNA電泳條帶將這兩種DNA電泳條帶分別從凝膠中切出，并用六氫吡啶進行切割，結(jié)果為： a、甲基化的G殘基被

10、切割:因為轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)只能夠同未發(fā)生甲基化的正常的結(jié)合位點結(jié)合，所以在轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點序列中的G殘基如果被DMS甲基化之后，轉(zhuǎn)錄因子就無法同其結(jié)合位點（順式元件）發(fā)生結(jié)合作用，從而使得結(jié)合位點中的G殘基同樣也要被六氫吡啶切割； b、不具有甲基化G殘基的靶DNA 序列則不會被切割 將結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA條帶和不結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA條帶，經(jīng)六氫吡啶切割作用之后，再進行凝膠電泳 作放射自顯影，讀片并分析結(jié)果3、結(jié)果判斷： a、同轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合的靶DNA序列，經(jīng)六氫吡啶切割之后，電泳分離呈現(xiàn)兩條帶，有一個空白區(qū) b、不同轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合的靶DNA序列，經(jīng)六氫吡啶切割后，電泳分離呈現(xiàn)三條帶，沒

11、有空白區(qū)域的出現(xiàn)。4、應(yīng)用： a、甲基化干擾實驗可以用來研究轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合位點中的G殘基之間的聯(lián)系； b、是足跡實驗的一種有效的補充手段，可以鑒定足跡實驗中DNA與蛋白質(zhì)相互作用的精確位置5、缺點： DMS只能使DNA序列中的G和A殘基甲基化，而不能使T和C殘基甲基化。五、體內(nèi)足跡實驗上面討論的三種研究轉(zhuǎn)錄因子與DNA相互作用的方法，有一個共同的不足之處在于它們是在體外進行的實驗，因此人們就會考慮這些實驗結(jié)果是否能夠反映細胞內(nèi)發(fā)生的真實生命過程，即細胞內(nèi)發(fā)生的真實的DNA與蛋白質(zhì)的相互作用情況。為了解答這個問題，科學(xué)家就設(shè)計出了一種體內(nèi)足跡試驗（in vivo foot-printing

12、 assay），該方法可以看做是體外DMS足跡實驗的一個變種。1、原理： 體內(nèi)足跡試驗的原理原則上同體外DMS足跡實驗無本質(zhì)差別，即 a、DMS能夠使G殘基甲基化； b、六氫吡啶能特異的切割甲基化的G殘基； c、同特異轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合的識別序列中的G殘基由于受到蛋白質(zhì)的保護而不會被DMS甲基化，于是不會被六氫吡啶切割； d、同對照的裸露的DNA形成的序列梯作比較，就會發(fā)現(xiàn)活細胞DNA形成的序列梯中缺少G殘基沒有被切割的相應(yīng)條帶。2、過程： 用有限數(shù)量的化學(xué)試劑DMS處理完整的游離細胞，使?jié)B透到胞內(nèi)的DMS濃度恰好導(dǎo)致天然染色體DNA的G殘基發(fā)生甲基化 對這些經(jīng)過DMS處理的細胞提取DNA，并

13、在體外加入六氫吡啶作消化反應(yīng) PCR擴增后作凝膠電泳分析，因為在體外實驗中用的是克隆的DNA片段其數(shù)量足夠，而在體內(nèi)足跡實驗中用的是從染色體DNA中分離獲得的任何一種特異的DNA，其數(shù)量是微不足道的，所以需要經(jīng)PCR擴增以獲得足夠數(shù)量的特異DNA 放射自顯影，讀片并記錄讀片的結(jié)果3、結(jié)果判斷： a、能夠同轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA區(qū)段其中G殘基受到保護因而不會被DMS甲基化避免了六氫吡啶的切割作用； b、體外裸露的DNA分子上，G殘基被DMS甲基化而被六氫吡啶切割。六、拉下實驗（Pull-down assay） 拉下實驗又叫做蛋白質(zhì)體外結(jié)合實驗（binding assay in vitro），是一種在試管中檢測蛋白質(zhì)之間相互作用的方法。其基本原理是將某種小肽（例如生物素、6-His標簽以及谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等）的編碼基因與誘餌蛋白的編碼基因重組，表達為融合蛋白。分離純化融合蛋白并與磁珠