當(dāng)歸與硝苯吡啶對(duì)慢性支氣管炎肺泡巨噬細(xì)胞胞漿游離鈣水平的影響

1、當(dāng)歸與硝苯吡啶對(duì)慢性支氣管炎肺泡巨噬細(xì)胞胞漿游離鈣水平的影響摘要目的：探討當(dāng)歸與硝苯吡啶對(duì)慢性支氣管炎(慢支)肺泡巨噬細(xì)胞胞漿游離鈣水平的影響。方法：對(duì)慢支緩解期患者7例和正常對(duì)照者6例進(jìn)行支氣管肺泡灌洗獲得的肺泡巨噬細(xì)胞經(jīng)分離、純化后，加Fura-2/AM負(fù)載，以Fura-2熒光比值法測(cè)定加當(dāng)歸、硝苯吡啶及LPS后胞漿游離鈣的水平。結(jié)果：慢支組肺泡巨噬細(xì)胞胞漿中基礎(chǔ)鈣水平(189.4723.69) nmol/L較正常對(duì)照組(99.6532.21) nmol/L明顯增高(P0.01)；LPS促進(jìn)慢支組肺泡巨噬細(xì)胞包括胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放引起的胞漿游離鈣水平升高(基礎(chǔ)鈣189.4723.69 nmol/

2、L; LPS組235.5330.30 nmol/L)(靜息鈣228.4127.36 nmol/L;氯化鈣+LPS組288.4743.68 nmol/L)(P均0.01)；當(dāng)歸及硝苯吡啶均抑制LPS對(duì)慢支組肺泡巨噬細(xì)胞胞漿游離鈣水平的升高作用(靜息鈣228.4127.36 nmol/L；氯化鈣+當(dāng)歸+LPS組236.6828.60 nmol/L；氯化鈣+硝苯吡啶+LPS組252.6437.05 nmol/L)(P均0.05)。結(jié)論：當(dāng)歸與硝苯吡啶通過(guò)抑制慢支患者肺泡巨噬細(xì)胞胞漿游離鈣水平升高，影響肺泡巨噬細(xì)胞的活化，對(duì)于慢支氣道內(nèi)的非特異性炎癥可能具有抑制作用。主題詞當(dāng)歸；硝苯地平；支氣管炎；巨

3、噬細(xì)胞；鈣中分類號(hào)R562.21文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1000-4718(2000)08-0738-03 Regulation of LPS-induced elevation of Ca2 intracellular level of alveolarmacrophages in chronic bronchitis by Angelica Sinensis and nifedipineZHANG Zhen-xiang, XU Yong-jian(Division of Pulmonary Medicine, Tongji Hospital of Tongji Medical Universi

4、ty, Wuhan 430030, China)PENG Ze, LIU Zhuo-la, SONG Man-jing(Division of Pulmonary Medicine the Second Affiliated Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China) AbstractAIM: To explore regulation of lipopolysaccharide (LPS)-induced elevation of Ca2 intracellular level in alveolar macroph

5、ages(AMs) from patients with chronic bronchitis by Angelica Sinensis and nifedipine.METHODS:AMs was obtained from 7 patients with chronic bronchitis and 6 normal controls by bronchoalveolar lavage and intracellular Ca2level was detected after adding Angelica Sinensis, nifedipine or LPS to the supern

6、atant of AMs loaded by Fura-2. RESULTS: In contrast with normal control group (99.6532.21 nmol/L), intracellular Ca2 level in AMs from chronic bronchitis group (189.4723.69 nmol/L) was increased significantly in the absence of extracellular Ca2 but not 1 mmol/L. Intracellular Ca2 level in AMs from c

7、hronic bronchitis group were significantly increased by adding 10 g/mL LPS to the supernatant of AMs. LPS-induced elevation of intracellular Ca2 level in AMs from chronic bronchitis group was completely inhibited by Angelica Sinensis or nifedipine.CONCLUSION: Both Anelica Sinensis and nifedipine may

8、 inhibit activation of AMs from patients with chronic bronchitis by reducing LPS-induced elevation of intracellular Ca2 level in AMs, suggested that these two medicines may inhibit non-specific inflammation of airways in chronic bronchitis.MeSHAngelica Sinensis; Nifedipine; Bronchitis; Macrophages;

9、Calcium慢性支氣管炎(慢支)是老年人一種常見(jiàn)病，氣道內(nèi)常存在不同程度的慢性非特異性炎癥，較多研究證明肺泡巨噬細(xì)胞為氣道局部炎癥反應(yīng)的主要始動(dòng)細(xì)胞1。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)等細(xì)菌表面有效抗原通過(guò)與肺泡巨噬細(xì)胞膜上CD11c/CD18和CD14兩種受體結(jié)合1，2，導(dǎo)致胞漿游離鈣水平的升高，進(jìn)而影響TNF-、IL-1、IL-10、IL-15、TGF-1等細(xì)胞因子的合成分泌3，參與局部的炎癥反應(yīng)。其中胞漿游離鈣水平增加的來(lái)源包括胞膜上鈣通道的開放和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等胞內(nèi)鈣庫(kù)的釋放。當(dāng)歸通過(guò)其鈣通道阻斷作用可緩解冠狀動(dòng)脈痙攣4，而硝苯吡啶在體外可減弱LPS對(duì)J774.2巨噬

10、細(xì)胞NOS的誘導(dǎo)作用5，并以劑量依賴的方式明顯減少酵母多糖誘導(dǎo)小鼠腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化氫6，有關(guān)當(dāng)歸對(duì)慢支氣道內(nèi)肺泡巨噬細(xì)胞胞漿游離鈣水平的影響及與硝苯吡啶的比較國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。我們通過(guò)觀察當(dāng)歸和硝苯吡啶對(duì)LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞胞漿游離鈣水平的影響，探討它們與肺泡巨噬細(xì)胞活化間的關(guān)系，為控制慢支緩解期氣道內(nèi)的炎性損害從治療角度提供一些線索。材料和方法一、材料(一)病例選擇7例老年慢支緩解期患者經(jīng)結(jié)合臨床病史體征、胸片及肺功能檢查確診，符合1979年全國(guó)慢性支氣管炎臨床專業(yè)會(huì)議診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中男5例，女2例，年齡5170歲，平均(6210)歲。另選6名門診老年患者健側(cè)肺作正常對(duì)照，男4例，女2

11、例，年齡4566 ，平均(608)歲。支氣管肺泡灌洗術(shù)前未服用或吸入糖皮質(zhì)激素史。(二)藥物與試劑25%當(dāng)歸注射液購(gòu)自湖北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院制劑室，硝苯吡啶、LPS(大腸桿菌血清型026B6)、EGTA和牛血清白蛋白購(gòu)自Sigma公司，Triton X-100和HEPES分別為SERVA公司及Merck公司產(chǎn)品，F(xiàn)ura-2/AM購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。二、方法(一)肺泡巨噬細(xì)胞的提取和純化參照有關(guān)支氣管肺泡灌洗及灌洗液處理的技術(shù)規(guī)范7收集肺泡巨噬細(xì)胞。經(jīng)無(wú)菌紗布過(guò)濾，D-Hanks液洗細(xì)胞3次后，以含15%小牛血清的1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，在37，5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)2 h，去上

12、清，以37無(wú)小牛血清的1640培養(yǎng)基洗細(xì)胞2次，將已純化的肺泡巨噬細(xì)胞懸浮于含2 mol/L谷氨酸、10 mmol/L HEPES和0.1%牛血清白蛋白的1640培養(yǎng)基中，存活率在90%以上。(二) 胞漿游離鈣水平的測(cè)定參照Crynkiewicz等8的方法，調(diào)整每管內(nèi)肺泡巨噬細(xì)胞為0.5106/mL4 mL 37預(yù)溫5 min后加入Fura-2/AM(終濃度為5 mol/L)，37恒溫振蕩45 min，用含0.1%牛血清白蛋白的D-Hanks液洗肺泡巨噬細(xì)胞3次，以無(wú)鈣鹽水(pH7.4)37再孵育5 min后置RF-5000熒光分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司)上測(cè)定胞漿游離鈣，激發(fā)波長(zhǎng)3

13、40 nm和380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)500 nm。分組情況見(jiàn)表1，所加氯化鈣、LPS、當(dāng)歸和硝苯吡啶的終濃度分別為1 mmol/L、10 g/mL, 125 g/mL, 30g/mL，且當(dāng)歸及硝苯吡啶先于LPS與肺泡巨噬細(xì)胞孵化10 min。肺泡巨噬細(xì)胞胞漿游離鈣水平測(cè)定所用公式為：Ca2i=Kd(Sf2Sb2)(R-Rmin)/(Rmax-R)。其中Kd為Ca2結(jié)合常數(shù)(224 nmol/L),R,Rmin和Rmax分別為測(cè)得的340和380的熒光比值，最大熒光比值，最小熒光比值。Sf2和Sb2分別為零Ca2和飽和Ca2時(shí)380激發(fā)光產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。三、統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)以s表示，兩均數(shù)間比較采用t

14、檢驗(yàn)。結(jié)果一、LPS對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞胞漿游離鈣水平的影響由表1所知，慢支組肺泡巨噬細(xì)胞胞漿基礎(chǔ)鈣水平明顯高于正常對(duì)照組(P0.01)，但靜息鈣水平在兩組間無(wú)顯著差異(P0.05)；LPS可促進(jìn)兩組的肺泡巨噬細(xì)胞鈣通道開放及胞內(nèi)鈣庫(kù)釋鈣(P均0.01)。二、當(dāng)歸對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞胞漿游離鈣的影響兩組的肺泡巨噬細(xì)胞在胞外鈣濃度為1 mmol/L時(shí)，加入LPS可明顯促進(jìn)胞內(nèi)游離鈣水平的升高，而肺泡巨噬細(xì)胞與當(dāng)歸提前孵化10 min可明顯抑制隨后LPS對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞的升鈣作用。三、硝苯吡啶對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞胞漿游離鈣的影響在胞外鈣濃度為1 mmol/L時(shí)，與兩組各自的肺泡巨噬細(xì)胞加入LPS時(shí)的胞內(nèi)鈣水平相比，提

15、前加入硝苯吡啶與肺泡巨噬細(xì)胞孵化10 min可明顯抑制LPS對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞的升鈣作用(P0.05)。表1當(dāng)歸與硝苯吡啶對(duì)LPS促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞胞漿游離鈣升高的影響Tab 1 Effects of Angelica Sinensis and nifedipine on LPS-induced Ca2i elevation in AMs(nmol/L,s)GroupNormal control(n=6)Chronic bronchitis(n=7)BasalCa2+i99.6532.21#189.4723.69#*LPS141.1520.96#235.5330.30#*CaCl2202.2538.

16、84#228.4127.36#CaCl2+LPS265.5422.72288.4743.68CaCl2+Angelica Sinensis+LPS227.8543.64236.6828.60CaCl2+nifedipine+LPS231.0461.71252.6437.05P0.01,vs basalCa2+i respectively; #P0.01, vs CaCl2+LPS group respectively; ?P0.01, vs normal control group 討論LPS與肺泡巨噬細(xì)胞膜上CD11c/CD18或CD14結(jié)合可能通過(guò)G蛋白介導(dǎo)快速激活磷脂酶C(phospho

17、lipase, PLC)9，進(jìn)而催化分解細(xì)胞膜成分磷脂肌醇為激活蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)和動(dòng)員鈣離子的二酰甘油(diacylglycerol, DAG)和肌醇三磷酸(inositol triphosphate, IP3)。隨著胞漿游離鈣的增加，鈣離子與PKC結(jié)合，促進(jìn)其向質(zhì)膜移位，并與位于質(zhì)膜上的DAG協(xié)同作用才能激活PKC。同時(shí)，LPS也可激活肺泡巨噬細(xì)胞的蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase, PTK)。無(wú)論P(yáng)KC和/或PTK的激活最終以蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞激活信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在我們的實(shí)驗(yàn)中已觀察到慢性支氣管炎患者的肺泡巨噬細(xì)胞

18、基礎(chǔ)鈣水平明顯升高，支持該類細(xì)胞的相對(duì)呈激活狀態(tài)，后者可促進(jìn)LPS在肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，加速各種炎性介質(zhì)的合成分泌，參與慢支氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展。慢支緩解期氣道內(nèi)存在不同程度的非特異性炎癥，與氣道局部增多的主要炎癥始動(dòng)細(xì)胞肺泡巨噬細(xì)胞激活有關(guān)。硝苯吡啶這一二氫吡啶類鈣通道拮抗劑與兩組的肺泡巨噬細(xì)胞提前孵化后再加LPS，LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞胞漿游離鈣增加的作用完全受抑，提示硝苯吡啶對(duì)LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞的激活有抑制作用。兩組的肺泡巨噬細(xì)胞與當(dāng)歸提前孵化后再加LPS，則LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞胞漿游離鈣增加的作用也完全受抑，支持當(dāng)歸為一種鈣拮抗劑，并提示當(dāng)歸對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞的激活有

19、抑制作用?？傊Ь徑馄跉獾纼?nèi)肺泡巨噬細(xì)胞胞漿基礎(chǔ)鈣水平的增高可能與其相對(duì)活化的肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量增多有關(guān)。當(dāng)歸與硝苯吡啶一樣，具有鈣拮抗作用。該兩種藥物均通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)慢支患者肺泡巨噬細(xì)胞胞漿游離鈣水平升高，影響肺泡巨噬細(xì)胞的活化過(guò)程，對(duì)在臨床上減緩慢支緩解期氣道內(nèi)非特異性炎癥方面可能有一定的參考意義。彭則（山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 山西 太原 030001）張珍祥（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 湖北 武漢 430030）徐永?。ㄍ瑵?jì)醫(yī)科大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 湖北 武漢 430030）劉卓拉（山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 山西 太原 030001）宋滿景（山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院

20、呼吸內(nèi)科， 山西 太原 030001）參考文獻(xiàn)1Monso E, Ruiz J, Rosell A, et al. Bacterial infection in chronic obstructive pulmonary diseaseJ. Am J Respir Cirt Care Med, 1995, 152(10):13161320.2Ingall RR, Golenbock DT. CD11c/CD18, a transmembrane signaling receptor for lipopolysaccharideJ. J Exp Med, 1995, 181:14731478.3Oshaughessy TC, Ansari TW, Barnes NC, et al. Inflammation in bronchial biopsies of subjects with chronic bronchitis: Inverse relationship of CD8+ T lymphocytes with FEV1J. Am J Respir Crit Care Med, 1997, 155(3):8528