Arg9人抗HBsAg單鏈抗體 EGFP融合蛋白基因的構(gòu)建、表達及活性分析(1)

1、Arg9/人抗HBsAg單鏈抗體/ EGFP融合蛋白基因的構(gòu)建、表達及活性分析(1)】 目的： 構(gòu)建帶有轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域Arg9編碼序列的R9/ScFv14/EGFP融合基因，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中進行表達，并分析表達產(chǎn)物與HBsAg的結(jié)合活性. 方法： 設計引物，將Arg9的編碼序列引入單鏈抗體基因的5端，PCR擴增后獲得帶有Arg9編碼序列的ScFv14基因，將PCR產(chǎn)物連入pMD18T載體，進行序列測定. 將測序正確的ScFv14基因和R9/ScFv14基因分別與EGFP基因連接后轉(zhuǎn)化入原核表達載體pET32a，獲得ScFv14/EGFP和R9/ScFv14/EGFP兩種融合基因的表達載體，轉(zhuǎn)化

2、大腸桿菌BL21(DE3)LysS，以IPTG誘導表達，對表達產(chǎn)物進行SDSPAGE分析，并用間接ELISA方法檢測其與HBsAg的親和活性. 結(jié)果： 經(jīng)酶切鑒定及測序證實ScFv14/EGFP融合基因和R9/ScFv14/EGFP融合基因序列完全正確.SDSPAGE分析表明兩種融合基因在大腸桿菌BL21中成功獲得表達，表達量分別占菌體總蛋白的20% 和25%.間接ELISA檢測證實所表達的ScFv14/EGFP融合蛋白和R9/ScFv14/EGFP融合蛋白均具有HBsAg結(jié)合活性. 結(jié)論： 成功構(gòu)建了帶有轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域Arg9編碼序列的R9/ScFv14/EGFP融合基因，并在大腸桿菌BL21中

3、成功表達，表達產(chǎn)物ScFv14/EGFP和R9/ScFv14/EGFP均具有與抗原HBsAg特異性結(jié)合的活性.【關鍵詞】 肝炎，乙型；肝炎表面抗原，乙型；ScFv；Arg90引言單鏈抗體（ScFv）是抗體重鏈可變區(qū)(VH)與輕鏈可變區(qū)(VL)通過一段連接肽(linker)連接而成的一種小分子抗體.其分子質(zhì)量僅為完整抗體的1/6，不僅能較好地保持抗原結(jié)合能力，并且具有分子質(zhì)量小、穿透力強、半衰期短、免疫原性低、制備流程簡單等特點，更有利于體內(nèi)應用1-3. 綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP) 是從水母中分離出來的一種發(fā)光蛋白,可在A450 nm490 nm

4、的藍光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，使用普通熒光顯微鏡即可進行觀察.是近年來細胞生物領域中應用最為廣泛的標記性蛋白質(zhì)之一.EGFP為一種突變型GFP，所產(chǎn)生的熒光比野生型GFP增強，可作為標簽用于檢測目的蛋白及指示目的蛋白的定位. ScFv與效應分子組成的融合蛋白能否高效地內(nèi)化入細胞對于其生物學功能的發(fā)揮具有非常關鍵的作用. Arg9是一個九聚精氨酸的短肽序列，是蛋白轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域（PTDs）的一種，它能夠?qū)⑴c之融合的蛋白攜帶入細胞內(nèi)4. 我們將抗HBsAg的單鏈抗體（ScFv14）基因5與EGFP基因融合，并將Arg9編碼序列融合到ScFv14/EGFP基因的5端，構(gòu)建帶有轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域Arg9的R9/ScF

5、v14/EGFP融合蛋白基因，將它們在大腸桿菌中進行誘導表達，并對表達產(chǎn)物的親和活性進行了分析.1材料和方法1.1材料含有編碼人抗HBsAg單鏈抗體ScFv14基因的載體pUC19ScFv14、大腸桿菌E.coli.DH5株和原核表達載體pET32a（第四軍醫(yī)大學生物化學與分子生物學教研室構(gòu)建5并保存）；EGFP融合蛋白表達載體pEGFPN3（Clontech公司）；DNA Marker, T4 DNA Ligase, pMD18T vector和限制性內(nèi)切酶BamH, EcoR, Not（TaKaRa公司）；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒（上海華舜公司）；Werstern blot 顯影液（P

6、ierce公司）.1.2方法1.2.1引物的設計與合成根據(jù)ScFv14基因序列，設計引物擴增ScFv14基因，并設計引物將Arg9的編碼序列引入ScFv14基因的5端，引物序列如下：14F 5 TTTGAATTCATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC 3；14R9F 5 TTTGAATTCATGAGACGCAGGAGACGCAGGCGGAGACGGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC 3； L3 5 TTTGGATCCTCGATTGATTTCCACCTTGGT 3. 其中劃線部分為九聚精氨酸的編碼序列.1.2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定以pUC19ScFv14為模板，分別以14F，L3

7、和14R9F，L3為引物擴增ScFv14基因和R9/ScFv14基因.反應條件：95 35 s， 55 45 s，72 1 min，共進行25個循環(huán).產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,膠回收試劑盒回收. 回收產(chǎn)物分別連入pMD18T載體,轉(zhuǎn)化E.coli.DH5宿主菌，挑取單克隆,提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，陽性克隆命名為pMD18TScFv14和pMD18TR9/ScFv14，送北京三博遠志生物技術(shù)公司測序.將測序正確的pMD18TScFv14和pMD18TR9/ScFv14用限制性內(nèi)切酶EcoR和BamH進行酶切，得到ScFv14和R9/ScFv14基因片段，將pEGFPN3用BamH和Not

8、酶切，得到EGFP基因片段.分別將ScFv14和R9/ScFv14基因與EGFP基因在16條件下連接4 h后，再連入經(jīng)EcoR和Not酶切的表達載體pET32a中，轉(zhuǎn)化E.coli.DH5后，篩選陽性克隆酶切鑒定.鑒定正確的質(zhì)粒分別命名為pET32aScFv14/EGFP和pET32aR9/ScFv14/EGFP.1.2.3融合基因的誘導表達及鑒定將pET32aScFv14/EGFP和pET32aR9/ScFv14/EGFP質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入E .coli.BL21，挑取單克隆菌落接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，220 r/min， 37培養(yǎng)過夜，次日以1100轉(zhuǎn)接，在220 r/min, 3

9、7條件下振蕩培養(yǎng)至A600 nm=0.40.6,加入IPTG至終濃度為1 mmol/L,誘導培養(yǎng)3 h，取1 mL誘導菌液離心，收集菌體，進行SDSPAGE分析.另取5 mL誘導菌液離心，收集菌體，以0.2 mol/L的TrisHCl(pH=8.0)重懸，超聲裂解后，離心取上清，沉淀用0.2 mol/L TrisHCl(pH=7.4)重懸，取上清和沉淀進行SDSPAGE分析.作者：薛茜，溫偉紅，孟艷玲，張勇，張巍，王濤，張瑞，楊安鋼 【關鍵詞】肝炎,乙型；肝炎表面抗原,乙型；ScFv；Arg9【Abs 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請

10、不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。1.2.4重組融合蛋白的Western blot分析將誘導菌進行SDSPAGE 分離蛋白質(zhì)，用半干式電轉(zhuǎn)儀將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC）上，經(jīng)50 g/L的脫脂奶粉封閉1 h，用鼠抗EGFP mAb（11000稀釋），4孵育過夜，用TBST洗膜6次，每次5 min,再加入辣根過氧化酶HRP標記的山羊抗小鼠IgG，室溫孵育1 h, 用TBST洗膜6次，每次5 min,按顯影液說明加入顯影液，用化學發(fā)光法進行檢測.1.2.5融合蛋白親和活性的ELISA檢測用5 mg/L HBsAg包被ELIS

11、A板,每孔100 L, 4過夜. 加入不同稀釋度的細菌裂解上清,每孔100 L, 37孵育1 h. 設空白和陰性對照. 洗滌后,加入鼠抗EGFP mAb（11000稀釋）,37孵育1 h. 洗滌后再加入辣根過氧化酶HRP標記的山羊抗小鼠IgG, 37孵育1 h. 最后各孔加入新鮮配制的ABTS顯色液100 L, 37孵育30 min,終止反應.以酶標儀測定各孔A410 nm值.2結(jié)果2.1目的基因擴增和酶切鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳證實分別擴增出大小約為750 bp和780 bp的條帶(圖1A) .測序結(jié)果證實擴增的ScFv14和R9/ScFv14基因完全正確. 用EcoR和B

12、amH雙酶切鑒定，得到大小約為750 bp和780 bp的條帶，與預期長度相符（圖1B）.2.2原核表達載體的酶切鑒定重組載體pET32aScFv14/EGFP和pET32aR9/ScFv14/EGFP用限制性內(nèi)切酶EcoR和BamH雙酶切ScFv14和R9/ScFv14基因，分別得到大小約為750 bp和780 bp的條帶；用EcoR和Not雙酶切融合蛋白基因，分別得到大小約為1490 bp和1520 bp的條帶,與預期長度相符（圖2）.2.3重組融合蛋白表達的鑒定和分析SDSPAGE分析顯示，與未誘導菌相比，兩種誘導菌在Mr約為73 ku處均有一特異性蛋白條帶，同預期的大小相符.經(jīng)凝膠成像

13、系統(tǒng)掃描顯示，它們的表達量分別約占菌體總蛋白的 20%和25%（圖3）. 取IPTG誘導后的菌液進行超聲裂解，分別取其裂解上清和沉淀進行SDSPAGE分析，電泳結(jié)果顯示兩種目的蛋白均主存在于誘導菌的裂解上清中（圖4）.2.4重組融合蛋白的Western blot分析在Mr約為73 ku處有一特異性蛋白條帶(圖5)，與SDSPAGE分析結(jié)果相符，說明該誘導蛋白為目的蛋白.2.5融合蛋白親和活性的ELISA檢測間接ELISA檢測結(jié)果顯示表達的兩種ScFv14/EGFP融合蛋白均能與HBsAg抗原特異性結(jié)合 (圖6), 二者相比，R9/ScFv14/EGFP 與HBsAg的親和力稍大于ScFv14/

14、EGFP與HBsAg，但不具有統(tǒng)計學意義（P0.05）. 2，4: 未誘導的pET32a和pET32aR9/ScFv14/EGFP的全菌蛋白質(zhì)； 3，5： IPTG 誘導的pET32a和pET32aR9/ScFv14/EGFP的全菌蛋白質(zhì). B1: marker； 2，4: 未誘導的pET32a和pET32aScFv14/EGFP的全菌蛋白質(zhì)； 3，5： IPTG 誘導的pET32a和pET32aScFv14/EGFP的全菌蛋白質(zhì).3討論天然Fv片段中VH和VL為非共價性結(jié)合，是抗體分子中保留抗原結(jié)合部位的最小功能片段.將VH和VL用一個小肽(linker)連接起來，即單鏈抗體. 單鏈抗體易與

15、效應分子相連，與其他蛋白融合，可得到具有多種生物學功能的融合蛋白.近年來，以單鏈抗體為導向物的免疫融合蛋白在抗腫瘤、抗病毒等的治療和診斷方面展現(xiàn)了廣闊的前景，引起了人們的廣泛關注.由單鏈抗體與毒素、酶、細胞因子等的基因相連的免疫融合蛋白，可以結(jié)合到特定的靶部位，高效的發(fā)揮生物學功能6-7 .蛋白轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域（PTDs）是一類能夠介導與之融合的蛋白內(nèi)化入細胞的短肽.它們作為內(nèi)化的工具被廣泛應用，它不僅可以使多肽、多聚核苷酸、極小微粒進入細胞，甚至可以在體內(nèi)介導蛋白質(zhì)的內(nèi)化8 . Futaki等9發(fā)現(xiàn)多種富含精氨酸的肽都具有轉(zhuǎn)膜作用.在比較了不同長度的多聚精氨酸對內(nèi)化效率的影響之后，他們發(fā)現(xiàn)八聚精氨

16、酸（Arg8）的內(nèi)化效果最好 . Wender等10發(fā)現(xiàn)Arg9具有更高效的內(nèi)化作用.我們采用轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域Arg9來增強融合蛋白的轉(zhuǎn)膜功能，以期使產(chǎn)物具有更高的內(nèi)化效率.我們構(gòu)建了帶有轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域Arg9的R9/ScFv14/EGFP融合基因表達載體，并將該表達載體在E .coli.BL21中進行誘導表達，SDSPAGE分析表明融合蛋白在大腸桿菌中成功表達，并且主在大腸桿菌的上清中表達，這就避免了變性復性的復雜過程，直接就可以獲得具有生物學功能的活性蛋白.間接ELISA檢測也證實融合有Arg9的ScFv14/EGFP融合蛋白與不帶有Arg9的ScFv14/EGFP融合蛋白對HBsAg具有相近的親和

17、活性.這為進一步研究Arg9對免疫融合蛋白內(nèi)化的促進作用以及為乙型病毒性肝炎的靶向治療研究提供了實驗基礎.【參考文獻】1 Kasuya K, Boyer JL, Tan Y, et al. Passive immunotherapy for anthrax toxin mediated by an adenovirus expressing an antiprotective antigen singlechain antibody J. Mol Ther, 2005,11(2):237-244.2 Neve RM, Nielsen UB, Kirpotin DB, et al. Biolog

18、ical effects of antiErbB2 single chain antibodies selected for internalizing function J. Biochem Biophys Res Commun, 2001,280(1):274-279.3 Rosana B, Michel M, Jules Mattes. Intracellular accumulation of the antiCD20 antibody 1F5 in Blymphoma cells J. Clin Cancer Res, 2002,8(8):2701-2713.4 Hea D, Yan

19、gb H, Lina Q, et al. Arg9peptide facilitates the internalization of an antiCEA immunotoxin and potentiates its specific cytotoxicity to target cells J. Int J Biochem Cell Biol, 2005,37(1):192-205.5 Wen WH, Zhao J, Yu CJ, et al. Construction of singlechain Fv Gene of AntiHBsAg and its expression in C

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