HIF－1α反義寡核苷酸體外對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的作用

1、HIF1反義寡核苷酸體外對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的作用                                      作者：易顯富, 楊賢義, 郭清浩, 康中山     

2、; 摘  要  目的:研究缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF1）反義寡核苷酸(ASODN)轉(zhuǎn)染對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響,探討以HIF1為靶點(diǎn)進(jìn)行反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染治療膠質(zhì)瘤的有效性。方法:設(shè)計(jì)合成針對HIF1的寡核苷酸片段.實(shí)驗(yàn)分6組：空白對照組、脂質(zhì)體組、正義組和反義組（1.0 mol/l、2.5 mol/l和5.0 mol/l）。利用脂質(zhì)體包裹瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251,MTT法檢測細(xì)胞增殖;采用AO/EB染色及末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果:轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞增殖抑制率分別為（1.30±0.05）、（1.98±0.35）、（2.47

3、77;0.48）、（22.30±2.08）、（33.60±4.19）和（56.20±4.22）。轉(zhuǎn)染HIF1反義寡核苷酸組較各對照組相比細(xì)胞增生下降, 凋亡增加（P<0.01）。 結(jié)論:HIF1反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系可以抑制細(xì)胞增生并誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，HIF1有望成為一個(gè)極具潛力的腫瘤治療的靶點(diǎn)。 關(guān)鍵詞  反義寡核甘酸類，反義；缺氧誘導(dǎo)因子1；膠質(zhì)瘤Abstract:Objective To investigate the effects of antisense oligodeoxynucleotides(ASODN) tar

4、geting HIF-1 on the apoptosis and proliferation of human glioma cell line U251 and to evaluate their efficacy as anticancer therapeutics.  Methods ASODN targeting HIF-1 was designed and syntherized. Cultured U251 cells were devided into 6 groups:control group,lipsomes group,sense oligodeoxynucl

5、eotides(SODN) group,1.0 mol/l ASODN group,2.5 mol/l ASODN group and 5.0 mol/l ASODN group. ODNs targeting HIF-1 transfected into U251 cells mediated by liposomal reagent. After transfected for 24 h , the cultured cells were harvested .Inhibitory rate(IR) by ASODN was determined by the colorimetri MT

6、T cell viability;Apoptosis index (AI) and the apoptotic cell morphological changes were measured by acridine orange-ethidium bromide (AOEB) double fluorescent dye staining and TUNEL under fluorescence inverted microscopy. Results The IR in 6 group was （1.30±0.05）,（1.98±0.35）,（2.47±0.4

7、8）,（22.30±2.08）,（33.60±4.19）,（56.20±4.22）,respectively. The IR and AI rate in 3 ASODN groups was significantly higher than that in any other control groups（P<0.01）. Conclusion ASODN targeting HIF1 may induce U251 apoptosis and inhibit proliferation. HIF1 could be a promising antica

8、ncer target .Key words:Oligodeoxynucleotide,Antisense;Hypoxia inducible factor 1;Glioma 惡性腫瘤在生長過程中,組織增生過快必然會(huì)造成局部組織缺氧和供能與耗能之間的不平衡1。缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor 1, HIF1）是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對缺氧等微環(huán)境發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)的主要核轉(zhuǎn)錄因子,能通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和糖酵解相關(guān)酶的表達(dá),增加供血、供氧、供能,改善這一失衡,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)2。HIF1是決定HIF1活性的亞單位,在許多惡性腫瘤中的過表達(dá)與腫瘤的血管

9、形成，侵襲轉(zhuǎn)移，放化療耐受等密切相關(guān), 抑制腫瘤中HIF1的表達(dá)則具有抗腫瘤效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)利用反義寡核苷酸技術(shù)(antisenseoligodeoxynucleotides, ASODN)合成針對HIF1的寡核苷酸片段,并利用陽離子脂質(zhì)體包裹瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251, 觀察其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為以HIF1為靶點(diǎn)的反義寡核苷酸治療膠質(zhì)瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1  材料與方法1.1  主要材料人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251（中科院上海細(xì)胞生物化學(xué)研究所）。TUNEL試劑盒、陽離子脂質(zhì)體Dosper(Roche公司)。SP試劑盒，鼠抗人HIF1（福州邁新生物技術(shù)公司），細(xì)胞培養(yǎng)用

10、1640（Gibco公司），胎牛血清（浙江杭州四季青公司），氯化鈷(上海一新試劑公司)。吖啶橙(AO)/溴乙錠(EB)(Fluka公司)。1.2  方法1.2.1  HIF1 ODN的合成與修飾:HIF1 AsODN 5'GCCGGCGCCCTCCAT 3',并設(shè)置了HIF1 SODN作為對照, 5'ATGGAGGGCGCCGGC-3'。全部堿基進(jìn)行硫代修飾，其中HIF1 AsODN 5'FAM熒光標(biāo)記。1.2.2  細(xì)胞培養(yǎng)與缺氧模型建立:人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系復(fù)蘇后,加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,置于37

11、 、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長達(dá)對數(shù)生長期時(shí)，換以含終濃度為125 mol/l氯化鈷的1640培養(yǎng)液進(jìn)行化學(xué)模擬缺氧, 置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)備用。1.2.3  實(shí)驗(yàn)分組與轉(zhuǎn)染:細(xì)胞懸液直接種至6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染時(shí)取對數(shù)生長期細(xì)胞，并融合50%60%，每種處理有5孔。實(shí)驗(yàn)分六組：不同濃度反義寡核甘酸組（終濃度分別為1.0,2.5和5.0 mol/l）、空白對照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對照組和正義寡核甘酸轉(zhuǎn)染對照組（終濃度為5.0 mol/l）。按照Dosper轉(zhuǎn)染試劑盒說明進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。1.2.4  反義寡核苷轉(zhuǎn)染后熒光觀察:轉(zhuǎn)染15 min,6 h,

12、24 h和48 h在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照，了解ODN在細(xì)胞內(nèi)的代謝和穩(wěn)定性，并初步判斷轉(zhuǎn)染效率。1.2.5  MTT法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性:U251細(xì)胞經(jīng)消化后計(jì)數(shù), 以1.5×105個(gè)/l接種96孔板,每孔200 l,10%小牛血清1640培養(yǎng)基,5%CO2、37 孵箱中培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)細(xì)胞分組同前。按照脂質(zhì)體試劑盒說明書進(jìn)行脂質(zhì)體包裹寡核苷酸片段及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,分別在普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后在培養(yǎng)細(xì)胞中加入MTT (5 /l)50 l/孔,繼續(xù)孵育4 h,加入DMSO100 l/孔,輕搖10 min后檢測波長490 nm的吸光度(A)值，每組3孔。計(jì)算細(xì)胞生長抑制

13、率抑制率=(空白對照組平均A值-用藥組平均A值)/空白對照組平均A值×100%。1.2.6  AO/EB雙染法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡:各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h分別消化離心收集棄上清,加入500 l培養(yǎng)液,配成細(xì)胞懸液,再加入實(shí)驗(yàn)用AO/EB 溶液20 l,混勻,置1滴于載玻片上,熒光顯微鏡下觀察200個(gè)細(xì)胞,分別計(jì)數(shù)早期凋亡細(xì)胞(VA)、晚期凋亡(NVA)、活細(xì)胞(VN)及非凋亡的死亡細(xì)胞(NVN),計(jì)算凋亡率。凋亡率=(VA+NVA)/(VA+NVA+VN+NVN)×100%1.2.7  TUNEL標(biāo)記法:實(shí)驗(yàn)分組及轉(zhuǎn)染同“1.2.3”所述。24 h后將各組

14、玻片取出按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行染色。觀察結(jié)果以所見細(xì)胞核有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞,每個(gè)樣品至少計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù),重復(fù)計(jì)數(shù)3次,取平均值，作為細(xì)胞凋亡指數(shù)（Apoptotic index,AI）。                             1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有結(jié)果均以x&

15、#177;s表示,不同組別的比較采用單因素方差分析。2  結(jié)果2.1  HIF1 AsODN后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記的HIF1 ASODN后15 min ODN粘附于細(xì)胞膜表面，但胞核無熒光積聚。轉(zhuǎn)染后6 h幾乎所有細(xì)胞均出現(xiàn)核內(nèi)均勻熒光積聚。此后核內(nèi)熒光持續(xù)存在，至轉(zhuǎn)染后24 h開始消退。48 h后,ODN僅偶見于個(gè)別細(xì)胞(見圖1)。2.2  MTT法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性    HIF1 ASODN轉(zhuǎn)染對膠質(zhì)瘤細(xì)胞有不同程度的抑制作用，且在一定的濃度范圍內(nèi)隨著ASODN濃度的增加而增強(qiáng)，與各對照組相比均有顯著性差異(P<

16、;0.01), 而SODN組、脂質(zhì)體組與空白對照組間比較無顯著性差異(P>0.05),見表1。2.3  AO/EB雙染法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡AO/EB雙熒光染色鏡檢可用于估計(jì)受檢細(xì)胞群體中細(xì)胞凋亡的發(fā)生率?；罴?xì)胞被AO染色發(fā)綠色熒光,細(xì)胞核呈現(xiàn)一至數(shù)個(gè)大小不等的圓珠狀凋亡小體，邊緣光滑、清晰,熒光亢進(jìn)且均勻一致，符合細(xì)胞凋亡的核形態(tài)特征(見圖2 )。細(xì)胞膜受損的晚期凋亡細(xì)胞則同時(shí)被EB 染色,核形態(tài)特征相同,但發(fā)橙紅色熒光。非凋亡的死亡細(xì)胞,核染色質(zhì)著橘紅色并呈正常結(jié)構(gòu)(見圖2 )。不同濃度HIF1 ASODN作用后各組的細(xì)胞凋亡率見表1 ,在同一時(shí)間點(diǎn)各濃度組凋亡率與空白對照組

17、相比均有顯著差異(P<0.01);在同一時(shí)間點(diǎn)脂質(zhì)體組、SODN組凋亡率與空白對照組相比無顯著差異(P>0.05)。2.4  TUNEL法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)后經(jīng)末端標(biāo)記法可觀察到凋亡細(xì)胞胞核被染成棕黃色(見圖3)。不同濃度的HIF1 ASODN均可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，凋亡指數(shù)與各對照組相比均有增加（P<0.01），見表1。表1  HIF1 ODN轉(zhuǎn)染對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖凋亡的影響(%, n=5,  略)注：與空白對照組相比較，*P>0.05；與各對照組相比較，P<0.013  討論反義寡核苷酸技術(shù)是根據(jù)堿基互補(bǔ)原則通

18、過人工合成一段與靶基因及其mRNA互補(bǔ)的寡核苷酸片段,與相應(yīng)靶基因或mRNA特異性結(jié)合,干擾基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程,從而達(dá)到削弱或抑制該基因功能的目的3。利用反義寡核苷酸技術(shù)的這一特點(diǎn),特異性抑制癌變中發(fā)揮重要作用的癌基因及生長因子等的表達(dá),遏制細(xì)胞的惡性增生,誘導(dǎo)其凋亡從而達(dá)到治療腫瘤的目的。HIF1是腫瘤細(xì)胞在低氧環(huán)境下賴以生長的核轉(zhuǎn)錄因子，由和兩亞單位組成異二聚體，HIF1決定其活性，而HIF1的功能則與維持其異二聚體結(jié)構(gòu)有關(guān)。HIF1在供氧正常時(shí)通過氧依賴性的泛素蛋白酶體途徑快速降解，而缺氧時(shí)HIF1與腫瘤抑制蛋白pVHL結(jié)合降解受阻大量積聚。HIF1與其下游靶基因啟動(dòng)子中一致性D

19、NA序列結(jié)合，啟動(dòng)VEGF、IGF2、Glut和CA IX等與腫瘤血管生成、增殖、凋亡和能量代謝密切相關(guān)的靶基因轉(zhuǎn)錄。反義基因技術(shù)在腫瘤防治中的應(yīng)用，最重要的一點(diǎn)是選擇合適的靶基因。最理想的靶點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞生長所必需而又不存在于正常細(xì)胞的細(xì)胞成分。Zhong H4等對腦腫瘤和正常腦組織研究發(fā)現(xiàn)，在癌組織中HIF1過表達(dá),且在腫瘤壞死明顯的區(qū)域和腫瘤浸潤的邊緣, HIF1表達(dá)明顯增多,而正常腦組織則未見HIF1表達(dá)。Sun 等56在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)用瘤內(nèi)注射反義HIF1質(zhì)粒能下調(diào)其靶基因VEGF表達(dá),減少腫瘤微血管密度，完全抑制微小腫瘤生長，并能增強(qiáng)癌癥免疫治療的效力。聯(lián)合應(yīng)用反義HIF1質(zhì)粒和pV

20、HL質(zhì)粒效果更佳，腫瘤HIF1、VEGF、微血管密度顯著減少，凋亡增加。Zhang Q7等證實(shí)HIF1反義基因治療能顯著抑制人舌鱗癌細(xì)胞增殖誘導(dǎo)其凋亡。氯化鈷能在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生類似缺氧狀態(tài)，細(xì)胞對氯化鈷刺激和缺氧刺激具有相同的氧感受、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制，因此氯化鈷模擬的體外實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)缺氧狀態(tài)下的研究結(jié)果具有很強(qiáng)的可比性89。在本實(shí)驗(yàn)中我們用氯化鈷復(fù)制膠質(zhì)瘤細(xì)胞缺氧模型，誘導(dǎo)HIF1表達(dá)，應(yīng)用反義寡核苷酸技術(shù)合成特異性的寡核苷酸，以陽離子脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251以抑制HIF1mRNA和蛋白的表達(dá)，應(yīng)用MTT法，AO/EB雙染標(biāo)記法和TUNEL等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染HIF1反義寡核苷酸后

21、膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長受到抑制，生長抑制率有顯著性差異（P<0.01）。細(xì)胞凋亡是指在活組織中,由內(nèi)在基因編碼調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡過程,是機(jī)體一種正常生理現(xiàn)象。細(xì)胞的凋亡決定細(xì)胞的死亡, 腫瘤細(xì)胞凋亡說明機(jī)體可通過自主地清除惡變的或可能惡變的細(xì)胞來對抗腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。細(xì)胞凋亡常參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展, 研究細(xì)胞凋亡對評(píng)估腫瘤預(yù)后有一定意義。AO/EB染色法則可以半定量檢測凋亡, 它不但可以檢測細(xì)胞的凋亡率, 而且還能了解膜受損細(xì)胞率, 是研究細(xì)胞凋亡的重要檢測方法。TUNEL方法是一種將細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察與分子生物學(xué)檢測相結(jié)合的有效而敏感的凋亡原位定量研究的方法。本實(shí)驗(yàn)中將兩種方法結(jié)合應(yīng)用，

22、研究發(fā)現(xiàn)HIF1反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染使膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率顯著增加。細(xì)胞增生和凋亡失衡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),并直接關(guān)系到腫瘤患者的愈后。本研究應(yīng)用反義HIF1寡核苷酸轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以抑制腫瘤細(xì)胞的增生并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,為進(jìn)一步進(jìn)行以HIF1為靶點(diǎn)的抗腫瘤治療研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。（文中圖13見封三）參  考  文  獻(xiàn)1 Harris AL.Hypoxia-a key regulatory factor in tumour growthJ.Nat Rev Cancer,2002,2(1):3847.     2 Richard DE, Berra E, Pouyssegur J. Angiogenesis: how a tumor adapts to hypoxiaJ. Biochem Biophys Res Commun,1999,266(3):718-722.     3 Stein CA,Cheng YC.Antisense oligonucleotides as therap