大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)產(chǎn)氣

1、GB4789.38-2012大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)技術(shù)支持技術(shù)支持 田亮田亮廣東微生物研究所廣東微生物研究所廣東環(huán)凱微生物科技有限公司廣東環(huán)凱微生物科技有限公司大腸桿菌的定義廣泛存在于人和溫血?jiǎng)游锏哪c道中，能夠在44.5發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、 IMViC生化試驗(yàn) (靛基質(zhì)、甲基紅、VP試驗(yàn)、檸檬酸鹽)為+ + - -或- + - -的革蘭陰性桿菌。衛(wèi)生學(xué)意義大腸桿菌的某些菌株對(duì)人有致病性。相對(duì)于大腸菌群和糞大腸菌群，大腸桿菌與糞便污染的相關(guān)性最好，是指示糞便污染最理想的指標(biāo)，應(yīng)用也最悠久。自1892年被提議作為糞便污染的指示菌以來(lái)，已被應(yīng)用了100多年 。為什么后來(lái)又有了大腸菌群和糞大腸菌群的應(yīng)用？主要

2、的原因是因?yàn)榇竽c桿菌的檢驗(yàn)過(guò)于復(fù)雜。隨著食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的日益科學(xué)和細(xì)化，以及對(duì)大腸桿菌檢驗(yàn)方法的不斷改進(jìn)，對(duì)特定食品的大腸桿菌的檢驗(yàn)需求肯定會(huì)越來(lái)越多?？勺鳛樵u(píng)價(jià)消毒效果的指示菌。大腸桿菌的生化特性形態(tài)與染色：革蘭染色朱陰性無(wú)芽胞的短小桿菌；多數(shù)菌株有58根鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。少數(shù)菌有莢膜。培養(yǎng)特性：需氧或兼性厭氧。最適溫度37，但在46也能生長(zhǎng)。最適pH7.47.6。 大腸埃希氏菌計(jì)數(shù) GB 4789.38-2012“大腸桿菌VRBAMUG平板計(jì)數(shù)”改為“大腸埃希氏菌平板計(jì)數(shù)法”刪除大腸桿菌PetrifilmTM測(cè)試片計(jì)數(shù)法GB478.38-2012大腸桿菌計(jì)數(shù)第一法：MPN法第二法：大腸埃希氏菌平

3、板計(jì)數(shù)法GB4789.38-2012第一法 大腸桿菌計(jì)數(shù)MPN法GB4789大腸桿菌計(jì)數(shù)MPN法檢驗(yàn)程序482h44.50.2482h樣品的稀釋固體和半固體食品：稱(chēng)取25g樣品，放入盛有225 mL生理鹽水或磷酸鹽緩沖液的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，于800010000 r/min均質(zhì)1min2min，或放入盛有225 mL生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用均質(zhì)器拍打1min2min，制成1:10的樣品勻液。樣品勻液的pH值應(yīng)在6.57.5之間，必要時(shí)分別用1.0mol/L氫氧化鈉或1.0mol/L鹽酸調(diào)節(jié)。用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品勻液1mL，沿管壁徐徐注盛有9mL磷酸鹽緩沖液的無(wú)菌試管中(注意

4、吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面)，振搖試管或換用一支1mL無(wú)菌吸管或吸頭反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無(wú)菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至接種完畢，全過(guò)程不得超過(guò)15min。初發(fā)酵試驗(yàn)選擇適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液）。每個(gè)稀釋度接種3管LST肉湯，每管接種1mL（如接種量需要超過(guò)1 mL，則用雙料LST肉湯），361培養(yǎng)24h2h，觀察小導(dǎo)管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣繼續(xù)培養(yǎng)至48h2h。記錄在24h48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST管數(shù)。如所有LST肉湯管均未產(chǎn)

5、氣，即可報(bào)告大腸桿菌MPN結(jié)果；如有產(chǎn)氣者，則進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)用接種環(huán)分別從所有48h2h內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST管取培養(yǎng)物1環(huán)，移種到已提前預(yù)溫至45的EC肉湯管中，放入帶蓋的44.50.2水浴箱內(nèi)，水浴的水面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面，培養(yǎng)24h2h，檢查小導(dǎo)管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣繼續(xù)培養(yǎng)至48h2h。記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的EC肉湯管數(shù)。如所有EC肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報(bào)告大腸桿菌MPN結(jié)果。如有產(chǎn)氣者，則進(jìn)行EMB平板分離培養(yǎng)。伊紅美藍(lán)平板分離培養(yǎng)輕輕振搖各產(chǎn)氣管，用接種環(huán)取培養(yǎng)物劃線(xiàn) 分 離 于 伊 紅 美 藍(lán) （ E M B ） 平 板 。361培養(yǎng)24h2h后，檢驗(yàn)平板上有

6、無(wú)具黑色中心有光澤或無(wú)光澤的典型菌落。營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面或平板培養(yǎng)從每個(gè)平板上挑選5個(gè)典型菌落，如無(wú)典型菌落則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面或平板上，36 1培養(yǎng)18h24h，取培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色和生化試驗(yàn)。生化試驗(yàn)靛基質(zhì)試驗(yàn)：將培養(yǎng)物接種于蛋白胨水，361培養(yǎng)24 h2h，加Kovacs靛基質(zhì)試劑0.20.3ml，上層出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性。MR-VP試驗(yàn)：將培養(yǎng)物接種于MR-VP培養(yǎng)基，361培養(yǎng)48h2h，移取培養(yǎng)物1ml至13mm100mm小試管中，加5%-萘酚乙醇溶液0.6ml、40%氫氧化鉀0.2ml和少許肌酸結(jié)晶。振搖后靜置2h，如出現(xiàn)伊紅色為VP試驗(yàn)陽(yáng)性。將MR-

7、VP試驗(yàn)剩余培養(yǎng)物再培養(yǎng)48h后，滴加5滴甲基紅試劑，培養(yǎng)物變紅為甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性；變黃為陰性。檸檬酸鹽利用試驗(yàn)：將培養(yǎng)物接種于Koser氏檸檬酸鹽肉湯， 361培養(yǎng)96h2h，記錄有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，生長(zhǎng)為陽(yáng)性。大腸桿菌與非大腸桿菌的生化鑒別靛基質(zhì)靛基質(zhì)(I)甲基紅甲基紅(M)VP試驗(yàn)試驗(yàn) (Vi)枸櫞酸鹽枸櫞酸鹽(C)鑒定鑒定(型別型別)典型大腸桿菌典型大腸桿菌非典型大腸桿菌非典型大腸桿菌典型中間型典型中間型非典型中間型非典型中間型非典型產(chǎn)氣腸桿菌非典型產(chǎn)氣腸桿菌非典型產(chǎn)氣腸桿菌非典型產(chǎn)氣腸桿菌大腸桿菌MPN計(jì)數(shù)的報(bào)告大腸桿菌為革蘭染色陰性無(wú)芽胞桿菌、發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣；MIViC試驗(yàn)為+-或-

8、+-。只要有1個(gè)菌落鑒定為大腸桿菌，其代表的LST肉湯管即為大腸桿菌陽(yáng)性。依據(jù)LST肉湯陽(yáng)性管數(shù)查MPN表，報(bào)告每g或每ml樣品中大腸桿菌MPN值。EC肉湯EC肉湯主要成分：乳糖、膽鹽、胰蛋白胨。大腸桿菌因分解乳糖而產(chǎn)氣，使小導(dǎo)管中可見(jiàn)氣泡。EC肉湯結(jié)果判定44.5 0.2培養(yǎng)接種前的EC肉湯產(chǎn)氣為陽(yáng)性不產(chǎn)氣為陰性EMB瓊脂上大腸桿菌的典型菌落與可疑菌落典型菌落：具黑色中心有光澤或無(wú)光澤的菌落。非典型的可疑菌落：粉紅色，無(wú)黑心典型的大腸桿菌的菌落典型的大腸桿菌的菌落非典型的大腸桿菌的菌落非典型的大腸桿菌的菌落MIViC試驗(yàn)原理甲基紅試驗(yàn)(I )原理：本試驗(yàn)是用甲基紅指示劑測(cè)定細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖時(shí)產(chǎn)

9、生的氫離子濃度的試驗(yàn)。大腸桿菌和大腸菌群能分解葡萄糖產(chǎn)生大量酸性產(chǎn)物，使甲基紅指示劑變?yōu)榧t色。注意：培養(yǎng)時(shí)間不得48h；接種菌量濃度不宜過(guò)大，否則細(xì)菌生長(zhǎng)受抑制，因此，接種量、試管大小應(yīng)盡量標(biāo)準(zhǔn)化，否則影響結(jié)果判定及重復(fù)性差靛基質(zhì)試驗(yàn)(M)原理：細(xì)菌(如大腸埃希菌、大腸菌群等)含有色氨酸酶，將蛋白胨中的色氨酸分解，生成靛基質(zhì)。靛基質(zhì)與對(duì)二甲基苯甲醛作用，形成紅色的玖瑰靛基質(zhì)(紅色的醇層，為醌型結(jié)構(gòu)的紅色集約化化合物)，呈紅色。注意：蛋白胨的色氨酸含量與靛基質(zhì)試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)密切相關(guān)，若蛋白胨水中加入0.21%的色氨酸或選用色氨酸高的胰蛋白胨做靛基質(zhì)試驗(yàn)效果更佳。VP試驗(yàn)(Vi)原理：本試驗(yàn)是檢查細(xì)

10、菌利用葡萄后所產(chǎn)生的代謝終產(chǎn)物乙酰甲基甲醇的實(shí)驗(yàn)。細(xì)菌在葡萄糖代謝中生成丙酮酸，丙酮酸僅是中間產(chǎn)物。隨細(xì)菌種屬不同而有多種分解途徑，使丙酮酸進(jìn)一步分解為不同的終產(chǎn)物，借此鑒定菌種。注意：在加入試劑時(shí)一定要加-萘酚，使其先與丁二酮和胍基復(fù)合物結(jié)合，而后再加入40%氫氧化鈉。若先加入40%氫氧化鈉溶液，氫氧化鈉可與培養(yǎng)基中蛋白胨某些成分反應(yīng)，產(chǎn)生橙紅色，造成假陽(yáng)性的結(jié)果。40%氫氧化鈉溶液的加入量不超過(guò)0.2ml，如過(guò)量可與-萘酚反應(yīng)出現(xiàn)棕色，使弱陽(yáng)性結(jié)果不易觀察。若已知的陽(yáng)性菌株，偶不出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)，可把含V-P試劑的培養(yǎng)物輕微加熱株，陽(yáng)性菌經(jīng)加溫后一般即可產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)。而陰性菌株仍為陰性反應(yīng)。

11、在V-P試驗(yàn)中，為檢出最小量乙酰甲基甲醇的最顯著變化，結(jié)果觀察可延至1h，但要注意氫氧化鈉對(duì)-萘酚的作用，不要將棕色錯(cuò)判為陽(yáng)性結(jié)果。也可將試驗(yàn)管置35培養(yǎng)4h后再觀察結(jié)果，若無(wú)紅色出現(xiàn)，即為陰性。檸檬酸鹽(枸櫞鹽)試驗(yàn)(C)原理：某些細(xì)菌可利用檸檬酸鹽為碳源，同時(shí)利用銨鹽為氮源提供能量而生長(zhǎng)。注意：本試驗(yàn)是以細(xì)菌生長(zhǎng)后培養(yǎng)基的濁度判定結(jié)果的。因此接種待試培養(yǎng)物過(guò)多時(shí)，容易造成假陽(yáng)性結(jié)果。一般宜采用滅菌生理鹽水制成菌懸液接種為好。I M Vi C試驗(yàn)的最佳觀察結(jié)果時(shí)間靛基質(zhì)試驗(yàn)：361，24h 2h；甲基紅試驗(yàn)：361，4d；滴加甲基紅試劑，出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性；出現(xiàn)黃色為陰性結(jié)果。V-P試驗(yàn)： 36

12、1，48h 2h；滴加試劑后若未出現(xiàn)伊紅色，應(yīng)再培養(yǎng)2h后再觀察結(jié)果。檸檬酸鹽試驗(yàn)： 361，96h 2h；觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。有細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基可變?yōu)樗{(lán)色。大腸桿菌-I M Vi C 試驗(yàn)靛基質(zhì)試驗(yàn)靛基質(zhì)試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn)V-P試驗(yàn)試驗(yàn)檸檬酸鹽試驗(yàn)檸檬酸鹽試驗(yàn)GB4789.38-2012第二法大腸埃希氏菌平板計(jì)數(shù)法原理4-甲基傘形酮-D-葡萄糖苷，英文縮寫(xiě) MUG。是一種不產(chǎn)生熒光的底物。由于96%的大腸桿菌都具有葡萄糖苷酶，能分解-D-葡萄糖苷，而使4-甲基傘形酮游離出來(lái)，在366nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)色熒光。觀察到藍(lán)色熒光即可認(rèn)為是大腸桿菌陽(yáng)性。MUG對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)繁殖既沒(méi)有抑制作用也沒(méi)

13、有促進(jìn)作用，對(duì)菌落形態(tài)也沒(méi)有影響。對(duì)VRBA-MUG平板計(jì)數(shù)法的評(píng)估優(yōu)勢(shì)：許多研究結(jié)果都證實(shí)，MUG方法的可靠性是相同于或高于常規(guī)MPN方法，準(zhǔn)確性高于疏水格濾膜法。當(dāng)普通變形桿菌等背景菌或雜菌存在時(shí)，對(duì)大腸桿菌發(fā)酵乳糖的產(chǎn)氣能力具有抑制作用，但對(duì)分解MUG產(chǎn)生熒光的能力沒(méi)有抑制作用。研究還證實(shí)，大腸桿菌的熒光反應(yīng)比產(chǎn)氣反應(yīng)出現(xiàn)得更早，并且不受食品的影響，目前，僅發(fā)現(xiàn)對(duì)牡蠣不適合用MUG方法，因?yàn)槟迪牼哂袃?nèi)源性葡萄糖苷酸酶。本方法是通過(guò)熒光的產(chǎn)生判定結(jié)果的，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所使用的器皿易受洗滌劑中的熒光增白劑的影響，而產(chǎn)生假陽(yáng)性或陰性對(duì)照顯熒光的現(xiàn)象。需在紫外燈下觀察結(jié)果與計(jì)數(shù)，時(shí)間太長(zhǎng)對(duì)人的眼睛有

14、損傷，實(shí)驗(yàn)時(shí)需特別的安全防護(hù) 。利用大腸桿菌能產(chǎn)生-葡萄糖苷酸酶的特性進(jìn)行檢驗(yàn)的方法除了MUG以外，還有5溴-4氯3吲哚-D葡糖苷酸等。平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇23個(gè)適宜稀釋度的樣液，接種VRBA-MUG平板紫外光下，計(jì)數(shù)發(fā)熒光的菌落報(bào)告結(jié)果3611824h檢驗(yàn)選取23個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度分別取1mL注入兩個(gè)無(wú)菌平皿。另取1mL樣品稀釋液注入一無(wú)菌平皿中，作空白對(duì)照。將預(yù)熱至45士0.5的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂10 mL15mL傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣品勻液充分混勻。待瓊脂凝固后，再加3 mL4mL V

15、RB-MUG覆蓋平板表層。 凝固后翻轉(zhuǎn)平板，361培養(yǎng)18 h24h。注：空白對(duì)照不加VRB-MUG覆蓋。大腸桿菌平板計(jì)數(shù)與報(bào)告選擇菌落數(shù)為10100的平板，暗室中360nm366nm波長(zhǎng)紫外燈照射下，計(jì)數(shù)平板上發(fā)淺藍(lán)色熒光的菌落。兩個(gè)平板上發(fā)熒光菌落數(shù)的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，報(bào)告每克(或毫升)樣品中大腸桿菌數(shù)，以cfu/g(mL)表示。大腸桿菌在VRBGA-MUG平板上的典型菌落ISO 16649-2:2001 5溴-4氯3吲哚-D-葡萄糖苷酶顯色培養(yǎng)基技術(shù)原理：葡萄糖苷酶陽(yáng)性的大腸桿菌經(jīng)44培養(yǎng)18h24h后，分解酶底物中的葡萄糖苷，使5溴-4氯3吲哚游離形成藍(lán)綠色的菌落。顯色培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)

16、法檢驗(yàn)程序檢樣25g(ml)+225ml稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇23個(gè)適宜稀釋度的樣液，接種TBX平板計(jì)數(shù)藍(lán)綠色的菌落報(bào)告結(jié)果441824h樣品的制備試驗(yàn)樣品的制備：參考ISO 6887-1和產(chǎn)品相關(guān)的具體國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。接種使用無(wú)菌吸管或移液器(6.5)，吸取1ml液體樣本或1ml其它樣本的初始懸浮液(10-1)，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌平皿中。 每一稀釋度接種二塊平皿。如有必要，重復(fù)上述操作接種樣本的更高稀釋度，每接種一個(gè)稀釋度更換一支無(wú)菌吸管。在接種后的平皿中傾注15ml事先在水浴箱中冷卻至4447的TBX培養(yǎng)基 。小心將培養(yǎng)基和接種物混勻，并將平皿放在冷的水平面上待其凝固。 從接種到傾注培養(yǎng)基不要超

17、過(guò)15min。 培養(yǎng)倒置已凝固的平皿， 將其放入培養(yǎng)箱中44培養(yǎng)18 h 24 h。但總培養(yǎng)時(shí)間不要超過(guò)24h。注：如樣品經(jīng)深加工，可將初始培養(yǎng)溫度設(shè)為37，培養(yǎng)4h后再提高至44培養(yǎng)18h24h。但培養(yǎng)溫度不要超過(guò)45。菌落計(jì)數(shù)在規(guī)定的培養(yǎng)結(jié)束后，選擇總菌落(典型和非典型菌落)數(shù)少于300CFU、典型菌落數(shù)少于150CFU的平板，計(jì)算每一個(gè)平板上典型的-葡萄糖苷酶陽(yáng)性的大腸桿菌菌落數(shù)。結(jié)果計(jì)算至少有一個(gè)平板其藍(lán)色菌落數(shù)不少于15CFU 時(shí)，按以下公式計(jì)算：dnnvaN)1 . 0(21a：兩個(gè)稀釋度所有平板藍(lán)色菌落數(shù)之和，其中兩個(gè)連續(xù)稀釋度中至少有一個(gè)稀釋度的藍(lán)色菌落數(shù)不少于15CFU。n1

18、：第一個(gè)稀釋度平板個(gè)數(shù)。V：每個(gè)平板接種的體積(ml)。n2：第二個(gè)稀釋度平板個(gè)數(shù)。d：稀釋因子，相當(dāng)于第一稀釋度 。如兩個(gè)平板的藍(lán)色菌落數(shù)少于15CFU，按以下公式計(jì)算： dnvcNE.c：兩個(gè)平板藍(lán)色菌落數(shù)之和。v：每個(gè)平板接種的體積(ml)。n：平板個(gè)數(shù)（在本例中n=2）。d：稀釋因子，相當(dāng)于第一稀釋度 。結(jié)果表達(dá)結(jié)果以?xún)晌挥行?shù)字表示。每ml(液體產(chǎn)品)或每g(其它產(chǎn)品)中-葡萄糖苷酶陽(yáng)性的大腸桿菌數(shù)以?xún)晌徽麛?shù)(如少于100時(shí))表達(dá)?；蛞?.09.9乘以10的指數(shù)表達(dá)。 大腸桿菌顯色培養(yǎng)基大腸桿菌顯色培養(yǎng)基大腸桿菌雜菌ECC顯色培養(yǎng)基-同時(shí)檢測(cè)大腸桿菌和大腸菌群大腸桿菌大腸菌群 產(chǎn)氣莢

19、膜梭狀芽孢桿菌檢驗(yàn) GB4789.13-2012內(nèi)容 產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的變更 液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基英文名字由FT改為FTG；步驟2003標(biāo)準(zhǔn)新的檢驗(yàn)方法選擇性分離SPS（亞硫酸鹽多粘菌素磺胺嘧啶瓊脂）TSC（胰月示-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂 ）生化鑒定動(dòng)力硝酸鹽、牛奶發(fā)酵、卵磷脂分解牛奶發(fā)酵乳糖明膠、緩沖動(dòng)力-硝酸鹽培養(yǎng)基（A）、牛奶發(fā)酵1 1、生物學(xué)特性、生物學(xué)特性 G+G+無(wú)鞭毛可形成莢膜和芽胞的大桿菌無(wú)鞭毛可形成莢膜和芽胞的大桿菌大?。捍笮。簽闉?1(12)2)mm X(2 X(210)10)mm 。芽孢芽孢：卵圓形位于菌體中央或近端，直徑大于菌體的：卵圓形位于菌體中央或近端，直徑大于

20、菌體的 直徑，有的菌株難形成芽胞。直徑，有的菌株難形成芽胞。莢膜：莢膜：在人和動(dòng)物活體組織內(nèi)，或在含血清的培養(yǎng)基在人和動(dòng)物活體組織內(nèi)，或在含血清的培養(yǎng)基 內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)可形成莢膜。內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)可形成莢膜。* *不嚴(yán)格的厭氧不嚴(yán)格的厭氧* *普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上可生長(zhǎng)，若加入葡萄糖、血液則生長(zhǎng)更好。普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上可生長(zhǎng)，若加入葡萄糖、血液則生長(zhǎng)更好。 * *適宜生長(zhǎng)溫度為適宜生長(zhǎng)溫度為37473747。* *生長(zhǎng)和繁殖速度極快生長(zhǎng)和繁殖速度極快，在適宜條件下，在適宜條件下8 8min/min/代代。* *在在4545高溫下可進(jìn)行快速分離純培養(yǎng)，每培養(yǎng)高溫下可進(jìn)行快速分離純培養(yǎng)，每培養(yǎng)3434h h 傳種傳種1

21、1次，較易分離純化次，較易分離純化。 ： 菌落周?chē)霈F(xiàn)菌落周?chē)霈F(xiàn)雙層溶血環(huán)雙層溶血環(huán)，內(nèi)層溶血完全，外，內(nèi)層溶血完全，外 層溶血不完全，好似靶狀，菌落本身略帶灰黃層溶血不完全，好似靶狀，菌落本身略帶灰黃 色至淺灰褐色，與色至淺灰褐色，與空氣接觸空氣接觸3030minmin后后，有時(shí)可能，有時(shí)可能 逐漸變?yōu)榛抑饾u變?yōu)榛揖G色綠色、甚至鮮綠色，這是本菌的特、甚至鮮綠色，這是本菌的特 征之一。征之一。 *發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖及蔗糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣， *液化明膠*還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。 * 暴烈式發(fā)酵”，是本菌的重要生化特征之一，也是鑒別的主要指標(biāo)。*能將亞硫酸鹽還原為硫化物亞硫酸鹽還原為硫化物， 在含

22、亞硫酸鹽及鐵鹽 的瓊脂中形成黑色菌落(5)(5)卵磷脂酶檢查試驗(yàn)：卵磷脂酶檢查試驗(yàn)：用接種環(huán)取用接種環(huán)取FTFT培養(yǎng)液點(diǎn)種于卵黃培養(yǎng)液點(diǎn)種于卵黃 瓊脂平板瓊脂平板( (每塊平板每塊平板 至少可接種至少可接種1010點(diǎn)點(diǎn)) )，于厭氧，于厭氧 培養(yǎng)，觀察接種點(diǎn)的變化。產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生卵培養(yǎng)，觀察接種點(diǎn)的變化。產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生卵 磷脂酶，分解卵黃中的卵磷脂，接種點(diǎn)的底部及磷脂酶，分解卵黃中的卵磷脂，接種點(diǎn)的底部及 周?chē)榘咨幕鞚釒?。周?chē)榘咨幕鞚釒А?毒素：毒素：產(chǎn)氣莢膜梭菌能產(chǎn)生產(chǎn)氣莢膜梭菌能產(chǎn)生外毒素外毒素和和腸毒素腸毒素。 外毒素：外毒素：致死毒素、壞死毒素和溶血毒素，致死毒素、壞死毒素

23、和溶血毒素， 毒性不強(qiáng)不耐熱。還有透明質(zhì)酸酶毒性不強(qiáng)不耐熱。還有透明質(zhì)酸酶 等酶類(lèi)。等酶類(lèi)。 腸毒素腸毒素：不耐熱，：不耐熱，6060經(jīng)經(jīng)1010minmin即可破壞不即可破壞不 耐酸，對(duì)堿有抵抗性，對(duì)胰蛋白酶耐酸，對(duì)堿有抵抗性，對(duì)胰蛋白酶 等蛋白分解酶比較穩(wěn)定。等蛋白分解酶比較穩(wěn)定。 分型：分型： 根據(jù)毒素和抗血清中和試驗(yàn)將此菌分成根據(jù)毒素和抗血清中和試驗(yàn)將此菌分成A，B，C ，D，E 和和F六個(gè)型。六個(gè)型。 A型：型：最常見(jiàn)，引起氣性壞疽和食物中最常見(jiàn)，引起氣性壞疽和食物中 毒；毒； A型型最早由最早由Welch andNuttal(1892)分離，分離， 所以叫衛(wèi)氏所以叫衛(wèi)氏/魏氏梭菌魏

24、氏梭菌 C型型：可引起腸炎。：可引起腸炎。 *對(duì)人致病的主要是對(duì)人致病的主要是A、C和和F型型 檢驗(yàn)程序檢驗(yàn)程序 46,25h 爆發(fā)酵爆發(fā)酵檢驗(yàn)程序檢驗(yàn)程序續(xù)續(xù)4.4.1 1 胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（TSC）瓊脂 - - 能將亞硫酸鹽還原為硫化物，在含亞硫酸鹽及能將亞硫酸鹽還原為硫化物，在含亞硫酸鹽及 鐵鹽鐵鹽( (含有檸檬酸鐵胺含有檸檬酸鐵胺) )的瓊脂中形成的瓊脂中形成黑色菌落黑色菌落；前面前面 分離培養(yǎng)和計(jì)數(shù)用分離培養(yǎng)和計(jì)數(shù)用 （TSC） 1 1活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng) ：1 1：1010稀釋的樣品用蛋白胨水依次稀釋的樣品用蛋白胨水依次 稀釋至稀釋至1010-2-21010-6-6倍，

25、取倍，取1 1mlml放入放入2 2個(gè)平板，分別加個(gè)平板，分別加 15 15ml TSCml TSC瓊脂，于瓊脂，于3636培養(yǎng)培養(yǎng)2424h h，選取長(zhǎng)有選取長(zhǎng)有3030030300 個(gè)黑色菌落的平板，計(jì)數(shù)黑色菌落數(shù)個(gè)黑色菌落的平板，計(jì)數(shù)黑色菌落數(shù)。 /course/fsc/441/resulex10.html/course/ fsc/441/resulex10.html2 2、證實(shí)試驗(yàn)、證實(shí)試驗(yàn) (1)(1)純培養(yǎng)：純培養(yǎng)：由平板上任取由平板上任取1010個(gè)黑色菌落，分別接種個(gè)黑色菌落，分別接種 FTG FTG培養(yǎng)基，于培養(yǎng)基，于(36(361)1)培養(yǎng)培養(yǎng)18182424h h，大量繁殖。，大量繁殖。 (2)(2)菌體形態(tài)和染色檢驗(yàn)菌體形態(tài)和染色檢驗(yàn)：用培養(yǎng)液涂片，革蘭氏：用培養(yǎng)液涂片，革蘭氏 染色鏡檢。產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭氏陽(yáng)性染色鏡檢。產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭氏陽(yáng)性 粗大桿菌，其耐熱株有卵形芽孢，位于粗大桿菌，其耐熱株有卵形芽孢，位于 菌體中央或近端。菌體中央或近端。(3)(3)檢查動(dòng)力和硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)：檢查動(dòng)力和硝酸鹽還原實(shí)