《抗菌藥物敏感試驗折點研究技術(shù)指導原則》

1、抗菌藥物敏感試驗折點研究技術(shù)指導原則（網(wǎng)上征求意見稿）一、 概述（一） 目的本指導原則為藥品注冊申請人和臨床試驗研究者在規(guī)劃、設(shè)計、實施和監(jiān)督抗菌藥物敏感試驗折點（以下簡稱：抗菌藥物折點）研究和敏感標準制定提供必要的技術(shù)指導，使安全有效的抗菌藥物得以更好更早地用于臨床治療。本指導原則主要適用于全身用藥的創(chuàng)新性抗菌藥物的臨床試驗。（二） 意義抗菌藥物折點（breakpoint）用來判斷病原菌對藥物敏感、中介或耐藥，其結(jié)果是臨床醫(yī)生選擇抗菌藥物治療病原菌感染的重要依據(jù)。我國目前還沒有折點制定原則，抗菌藥物臨床應用時所采用的折點多是國際已有的標準，但對于自主研發(fā)的I類新抗菌藥物等，無國際折點參考。必

2、須進行相關(guān)研究以制定藥敏折點，保障臨床醫(yī)生能根據(jù)正確的藥敏結(jié)果，合理應用抗菌藥物。（三） 基本研究過程及與抗菌藥物研發(fā)的整體關(guān)系抗菌藥物折點的確立涉及臨床前體內(nèi)外抗菌作用研究、藥物代謝動力學研究、臨床各期研究等多個藥物研發(fā)環(huán)節(jié)，是新藥研究中的一項重要內(nèi)容。折點研究貫穿新藥研究全過程，其研究原理可以概括為：在了解藥物自身的抗菌特點、對各種致病菌作用強弱后，通過體外和動物試驗，或直接通過動物試驗，建立PK/PD指數(shù)及反映療效的靶值。并利用此指數(shù)、靶值與人體結(jié)果有較好一致性的特點，進而建立抗菌藥物體外抑菌濃度與預期臨床療效間的關(guān)系，最終確定對感染部位使用推薦藥物劑量時，該致病菌株能被通?？蛇_到的抗菌

3、藥物所抑制的濃度。折點制定過程中，有些數(shù)據(jù)可能來源于其他研究項目。如：菌株的MIC值、藥物殺菌曲線、抗生素后效應值、藥物血漿蛋白結(jié)合率、藥物人體藥代參數(shù)等。當使用外來數(shù)據(jù)時，首先要求數(shù)據(jù)可溯源。其次，測定、分析方法符合折點制定的要求。如：MIC測定所用方法相同、測定范圍需涵蓋整個MIC分布；殺菌曲線圖能反映出完整的藥物濃度對殺菌速率的影響等。（四） 應用范圍本指導原則主要用于指導新抗菌藥物折點研究，目前僅限定為抗細菌藥物，創(chuàng)新抗真菌藥物也可參照。二、 實驗室要求（一） 實驗室資質(zhì)獲得有質(zhì)控和質(zhì)量保證的各項試驗結(jié)果是確定準確折點的基礎(chǔ)。對于開展體外藥效學研究的實驗室，在進行折點相關(guān)的微生物實驗時

4、，需要全程伴隨質(zhì)控；同時在實驗過程中，盡量采用國際通用的研究方法，使獲得的不同地區(qū)和國家的數(shù)據(jù)具有可比性。對于開展藥代動力學研究的實驗室，包括生物樣品分析、藥代動力學統(tǒng)計分析等，同樣應建立相應的質(zhì)量保證體系。進行感染動物PK/PD指數(shù)及靶值確定的動物實驗室應為符合國家要求、具有實驗動物使用許可證的從事感染動物研究的實驗室。具體要求可參照各項試驗相關(guān)的指導原則。（二） 人員資質(zhì)各項實驗人員應具有相應的實驗技能與工作經(jīng)歷，應經(jīng)過GCP培訓并獲得證書。經(jīng)過其所從事專業(yè)的培訓，具有滿足試驗要求的試驗能力或獲得相關(guān)證書。如：從事動物試驗的人員應具有實驗動物從業(yè)人員上崗證等。了解實驗室的各項管理規(guī)范與操作

5、規(guī)程。（三）統(tǒng)計與數(shù)據(jù)管理執(zhí)行抗菌藥物臨床試驗微生物實驗室技術(shù)指導原則和抗菌藥物藥代動力學/藥效學研究技術(shù)指導原則中關(guān)于統(tǒng)計分析與數(shù)據(jù)管理的各項規(guī)定。（四）注意事項/問題處理折點建立需運用體外、動物藥代、藥效、人體藥代、臨床療效等多種數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)伴隨著藥物研發(fā)逐步積累。多來源的數(shù)據(jù)可增加代表性與可靠性，但同時也對數(shù)據(jù)質(zhì)量提出更高要求。因而，藥物研發(fā)者應在早期對折點建立方法詳細了解，每一階段的研究研究中，除應符合個階段研究要求，還需考慮最終數(shù)據(jù)的統(tǒng)合，制定較為統(tǒng)一的研究方案與質(zhì)量控制、保證體系，使研發(fā)過程中更多的數(shù)據(jù)可納入到折點制定中來。如：在早期體外藥效學研究中，即開展MIC測定方法的比較研

6、究，最終確定適合研發(fā)藥物的測定方法并在以后的研究中保持一致。再如：臨床研究的同時開展患者PK/PD研究或PPK研究，同時獲得多方數(shù)據(jù)。三、 流行病學界值（Epidemiological Cutoff, Ecoff）的建立（一） 菌株要求由于臨床微生物存在著耐藥的變遷和區(qū)域的差異，測試菌株應為近3年內(nèi)臨床分離非重復菌株（一些收集困難的菌種可考慮5年內(nèi)的臨床分離株）。來自3個或以上有代表性地區(qū)。針對該抗菌藥物抗菌譜中的臨床常見致病菌種，以種為單元進行統(tǒng)計分析。理論上，同一屬或科的不同菌種間，如MIC眾數(shù)相差在2倍或以內(nèi)，可合并統(tǒng)計?？紤]到實用性，也可參考CLSI（）和EUCAST（）的細菌分組方式

7、，每組為一統(tǒng)計單元。每單元進入統(tǒng)計的野生型株數(shù)不少于100株，其中腸桿菌科、葡萄球菌屬等單元，由于其中包含的菌屬、菌種較多，每單元測定菌株數(shù)一般不少于300株。葡萄球菌屬應包含金葡菌和凝固酶陰性葡萄球菌。（二） 測定方法按照CLSI和EUCAST有關(guān)抗菌藥物敏感試驗稀釋法要求，采用肉湯稀釋法或瓊脂稀釋法進行MIC測定。之前藥效學研究如已證明2種測定方法無顯著差異，可任選一種方法；如之前未做方法學比較研究，需在此進行方法學比較并明確該藥物體外藥敏試驗方法。藥物濃度選擇：需要選擇較寬的藥物濃度范圍以涵蓋菌株的全部MIC分布，以便畫出完整的MIC分布圖形。測定單位數(shù)量：MIC測定需在3個或以上不同單

8、位進行。測定前制定統(tǒng)一方案，采用相同的測定方法及相同的材料。各單位測定結(jié)果差異不宜過大（MIC分布在正負一個稀釋度），如差異過大，需分析原因，重新考評各測定單位等。（三） 結(jié)果判定頻數(shù)分布圖目測方法：以MIC值為橫坐標，菌株數(shù)或菌株所占百分比為縱坐標作圖。野生型菌株MIC呈對數(shù)正態(tài)分布。取一個完整正態(tài)分布的高MIC值端為Ecoff1。當分布呈現(xiàn)雙峰形態(tài)時，說明所測菌株中含非野生型菌株，需剔除后重新作圖計算。這種方法簡易直觀，對于MIC具有單峰或明顯雙峰分布的細菌-藥物組合（圖1-a，1-b）效果較好，而對于野生型和非野生型有部分重合的細菌（圖1-c）則效果不好。aEcoffbC圖1 MIC分布

9、與Ecoff確定統(tǒng)計學方法2：基于對數(shù)正態(tài)分布這一特性，選擇合適的統(tǒng)計學方法，如：非線性最小二乘回歸等，對不同范圍實測值進行擬合（如圖1-c，分別對MIC值0.0160.125, 0.0160.25，0.0168的不同亞區(qū)間進行擬合）。以擬合值與實測值相差最小的點為Ecoff。統(tǒng)計學方法的優(yōu)勢在于不會因人而異，并且可以給出正確概率。五、PK/PD界值（Pharmacokinetics/Pharmacodynamics Cutoff, PK/PD Cutoff）的建立（一） 建立PK/PD界值所需的體外研究包括：確定抗菌藥物殺菌模式、后效應（postantibiotic effect, PAE）

10、以及獲得人體給藥后的不同時間游離藥物濃度數(shù)據(jù)。抗菌藥物殺菌模式的確定：這部分數(shù)據(jù)在臨床前的藥效學研究中應與體現(xiàn)。隨藥物濃度增加，特別是在大于48倍MIC藥物濃度后，殺菌速度與程度仍相應增加，為濃度依賴型殺菌藥物，而相關(guān)性不好的提示為時間依賴型殺菌藥物。另外，還需要確認新抗菌藥物是否具有中等或較長的PAE。測定新抗菌藥物人血漿蛋白結(jié)合率（f）：PK/PD研究中抗菌藥物的PK參數(shù)應基于游離藥物濃度得到，因此需測定藥物人血漿蛋白結(jié)合率。目前常用檢測血漿蛋白結(jié)合率實驗方法有平衡透析法、超過率法等。以上3個數(shù)據(jù)可由臨床前的藥效（殺菌模式、PAE）、I期臨床試驗（血漿蛋白結(jié)合率）中獲得。其中藥物殺菌模式和

11、PAE作為之后確立與療效相關(guān)PK/PD參數(shù)的驗證。血漿蛋白結(jié)合率則直接用于之后的計算中。（二） 確立與療效相關(guān)PK/PD指數(shù)PK/PD 指數(shù)包括f T>MIC%，f AUC/MIC，fCmax/MIC，不同類型抗菌藥物與三個指數(shù)的相關(guān)性也不同，濃度依賴型殺菌藥物通常與療效相關(guān)PK/PD指數(shù)為f AUC/MIC或fCmax/MIC；時間依賴型殺菌藥物，根據(jù)其PAE長短，分別對應f AUC/MIC和f T>MIC%。確定與療效相關(guān)的PK/PD指數(shù)可直接在動物模型中進行，也可先在體外建立動力學模型，而后對重要數(shù)據(jù)結(jié)果在動物模型中加以驗證1在動物模型中確立相關(guān)PK/PD指數(shù)動物PK/PD模

12、型可以使用來自人體感染的病原菌建立，其確定的PK/PD指數(shù)及靶值與臨床研究結(jié)果有較好的一致性，因此，來自動物的PK/PD研究所獲得的指數(shù)和靶值對確定人體的PK/PD界值非常有幫助4。建立感染動物模型，主要有免疫缺陷小/大鼠大腿感染模型、免疫缺陷小/大鼠肺炎模型等。以上2種模型為研究最成熟、使用最多的模型，也可根據(jù)藥物自身特點及預計臨床適應證，選擇相應其他模型，如：膿毒血癥模型、尿道感染模型等。不論哪種模型，都應首先造成免疫缺陷狀態(tài)以排除不同免疫力對結(jié)果的干擾，直接觀察藥物對細菌的作用。常用腹腔注射環(huán)磷酰胺的方法致小/大鼠中性粒細胞缺少（<100/mm3）來消除免疫狀態(tài)的影響。獲得感染動物

13、藥動學參數(shù)：參見化學藥物非臨床藥代動力學研究技術(shù)指導原則相關(guān)內(nèi)容。注意：1血漿蛋白結(jié)合率可以有種屬差異，需要使用感染動物模型中所用動物的血漿蛋白結(jié)合率；2通常情況下，其中的PK研究選用體循環(huán)中的藥動學參數(shù)即可。對于某些特殊的抗菌藥物或適應證，組織細胞外液的濃度和體循環(huán)中的藥物濃度會存在差異，如果能夠測定細胞外液中的藥物濃度并驗證其與體循環(huán)中藥物濃度的一致性，可為能否使用體循環(huán)PK參數(shù)進行PK/PD界值的確定，提供數(shù)據(jù)支持。目前已經(jīng)有一些手段可以測定細胞外液中的游離藥物濃度，如肺泡灌洗、微透析測定中樞神經(jīng)液中的藥物濃度等5獲得感染動物藥效學數(shù)據(jù)：首先選擇藥效指標，常用治療組與陽性對照組（未給予藥

14、物治療）每克組織、每毫升液體或每個組織中菌落數(shù)差值的對數(shù)作為藥效指標，也可直接通過生存率觀察藥效。前者可于感染動物后若干小時開始給藥，一般給藥24h后開始菌落計數(shù)；后者常需治療2d以上，再觀察數(shù)天。給藥方式采用劑量解析/分層法（Dose fractionation），即將45種日劑量以多種頻率（如：Q24h、Q12h、Q8h、Q6h、Q4h）給藥，使PK/PD關(guān)系圖中不同區(qū)間均有合理的點數(shù)覆蓋。確定相關(guān)性最好的PK/PD指數(shù)：分別以3個PK/PD指數(shù)為橫坐標，藥效學數(shù)據(jù)為縱坐標作圖，擬合度最好的即該藥物的PK/PD指數(shù)。如圖3顯示AUC/MIC為相關(guān)性最好指數(shù)，圖4顯示T>MIC%為相關(guān)

15、性最好指數(shù)。圖3 喹諾酮類藥物治療金黃色葡萄球菌小鼠大腿感染PK/PD分析6圖4 頭孢類藥物治療肺炎鏈球菌小鼠肺炎PK/PD分析需要測定的菌株種類與數(shù)量：針對新抗菌藥物抗菌譜和預計臨床適應證選擇，應覆蓋主要目標適應癥細菌，一般需35株，且部分菌株的MIC值應在其野生型分布的高MIC值端。菌種中有藥敏試驗質(zhì)控菌株的建議首選質(zhì)控菌株，。2建立體外動力學模型，確立PK/PD相關(guān)指數(shù)所建體外動力學模型需滿足以下2個條件：1 至少可模擬出一級動力學的濃度變化，即通過泵速和容器容積的調(diào)節(jié)，造成藥物濃度呈指數(shù)型衰減，可以準確模擬人體血藥濃度半衰期；2 藥物濃度動態(tài)變化時，保證細菌濃度不被稀釋。通過所建體外動

16、力學模型，采用劑量解析法，測定不同菌種的不同菌株在不同給藥條件下菌落數(shù)的改變，作圖得到PK/PD相關(guān)指數(shù)（同動物模型研究方法）。體外動力學模型與動物體內(nèi)感染模型相比有以下優(yōu)點：1 較易模擬人體血藥濃度的變化；2 便于采集多點樣本；3 減少動物的消耗；4 對在動物體內(nèi)不易生長的菌種特別有用。缺點是：1 完全不包含生物體對感染與藥物的應答；2 對技術(shù)要求高，有些技術(shù)問題，如細菌吸附、污染和過濾層阻塞等，如處理不好會影響試驗結(jié)果。因此，如果采用體外動力學模型進行PK/PD相關(guān)指數(shù)研究，還需對重要數(shù)據(jù)以動物模型加以確認，但可以減少動物實驗時的菌株數(shù)量、給藥劑量以及給藥間隔。此外，體外建模通常是模擬血藥

17、濃度變化，當感染部位組織濃度與血濃度差異大時，注意二者間差異，需要時對模型參數(shù)適當調(diào)整。（三） 確立PK/PD靶值范圍方法基本同于確立PK/PD指數(shù)。不同之處在于：1，根據(jù)上述結(jié)果適當減少給藥頻率；2，加大劑量范圍；3，增加菌株種類與數(shù)量，覆蓋新抗菌藥物抗菌譜中主要菌種，且每種細菌含若干不同MIC值的菌株，甚至包括超出Ecoff的菌株。以此觀察隨PK/PD指數(shù)值改變時藥效學數(shù)據(jù)的變化，依次找到藥效學數(shù)據(jù)處于靜態(tài)（菌落數(shù)沒有明顯變化）、降低1個log值、降低2個log值時所對應的PK/PD值，此數(shù)值范圍即PK/PD靶值范圍。其上、下限值可認為分別對應臨床免疫力正常與缺陷患者。確立PK/PD靶值同

18、樣可以選擇直接進行動物實驗或先在體外模型中試驗，再對重要結(jié)果以動物實驗驗證。（四） 計算機模擬獲得PK/PD界值從早期臨床試驗中獲得健康受試者PK參數(shù)，以推薦臨床試驗用給藥方案所對應藥代參數(shù)，結(jié)合體外大樣本細菌MIC分布，以動物實驗中獲得的PK/PD靶值范圍作為取得不同臨床和微生物療效的靶值范圍，通過蒙特卡洛模擬，計算PK/PD指數(shù)達到某靶值的累積響應百分率（cumulative fraction of response, CFR）以及在不同MIC濃度下的達標概率（probability of target attainment, PTA），以PTA=90%時的MIC值作為PK/PD界值。注意

19、：有效藥物濃度一般指游離藥物濃度。模擬時需使用可靠模擬軟件，藥動學參數(shù)服從對數(shù)正態(tài)分布（Log Gaussian distribution），f服從均勻分布（uniform distribution），MIC服從獨立分布（random distribution），模擬次數(shù)一般不少于5000次。針對不同PK/PD指數(shù)，選擇相應計算公式。其中f T>MIC%的計算公式中應包涵輸注時間。健康受試者的PK參數(shù)變異較小，臨床研究后期，如果獲得目標適應癥患者的PK數(shù)據(jù)，可以該數(shù)據(jù)再進行蒙特卡洛模擬，重新確PK/PD 界值7六、 確立臨床試驗用初始折點分別獲得Ecoff和PK/PD 界值，如PK/PD

20、 界值低于Ecoff，要看其位于野生型菌株正態(tài)分布的何處。如果落在接近正態(tài)分布的高MIC值一端，即按照PK/PD 界值，只有少量野生型敏感菌株被劃入“非敏感”范疇，則選擇PK/PD 界值作為臨床試驗用臨時敏感折點；如位于正態(tài)分布的中間甚至低MIC一端，則認為此種或此組細菌對該藥物“非敏感”，應于抗菌譜中去除。如PK/PD 界值是Ecoff的2倍，仍取PK/PD界值作為臨床試驗用臨時敏感折點。如相差4倍或更高，可參照已知同類藥物中化學結(jié)構(gòu)相近藥物的敏感折點，選擇與已知藥物折點相近的作為初步敏感折點，同時需分析差距大的原因，必要時需重復部分試驗。平衡折點時還應考慮到其實用性，在新藥臨床試驗中，不宜

21、針對一個藥物制定過多折點。七、 建立、確定申請上市折點（一） 通過群體藥代動力學研究驗證初始折點在臨床研究期間，對入選感染患者同時進行群體藥代動力學研究（PPK）并與之前體外藥效相結(jié)合，或直接進行群體藥代動力學/藥效學研究，在大樣本的基礎(chǔ)上進行驗證。按照稀疏點采樣的方法采集不同時間點的血樣，同時收集患者的各種信息，建立PPK模型；收集盡可能多患者的細菌藥物敏感性試驗結(jié)果（血和感染部位），進行PPK/PD研究；綜合體外藥敏結(jié)果、藥代參數(shù)、細菌學療效、臨床轉(zhuǎn)歸以及安全性，評價初步折點是否合適?？咕幬锶后w藥代動力學研究內(nèi)容、要求及結(jié)果分析等詳見群體藥代動力學研究技術(shù)指導原則。（二） 患者經(jīng)典PK/

22、PD研究驗證選擇一定例數(shù)細菌培養(yǎng)陽性患者，采集完整的藥代動力學樣本進行藥物濃度測定，綜合體外藥敏結(jié)果、藥代參數(shù)、細菌學療效和臨床轉(zhuǎn)歸，對目前所用折點進行評價。但考慮到這種研究所入選患者例數(shù)有限，故其結(jié)果僅供參考。如在II期臨床試驗階段即出現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)歸與藥敏結(jié)果不符現(xiàn)象，則應參照臨床結(jié)果適當調(diào)整，并于下一階段的臨床試驗中繼續(xù)驗證。八、 上市后折點標準的評估與修訂上市后折點標準的評估：隨著藥品上市后的擴大應用，收集特殊人群的藥代、細菌學療效、臨床轉(zhuǎn)歸數(shù)據(jù)，對折點進行評估。當臨床失敗率超過預期時，應啟動對折點的再評估。通常建立的折點可用于各感染部位，但如果藥物濃度或滲透性在身體某部位明顯不同，則可能需

23、要制定針對此部位的折點。再有，當藥物改變臨床使用劑量時，應申請相應折點的改變。九、 建立抑菌圈直徑與MIC間相關(guān)性，確定紙片擴散法的敏感折點8考慮到對于臨床微生物實驗室，紙片法測定藥物敏感性更為靈活方便，因此需完成藥敏紙片與MIC相關(guān)性的建立工作。如果按照以下要求，未發(fā)現(xiàn)藥敏紙片抑菌圈與MIC的相關(guān)性，則臨床試驗中仍需使用稀釋法測定該藥敏感性。1確定紙片所含藥物濃度可以選擇已上市同類藥物中化學結(jié)構(gòu)相似品種所使用的藥敏紙片濃度作為新抗菌藥物的紙片濃度。但對于新類別的抗菌藥物、理化性質(zhì)改變較大的藥物、藥代參數(shù)與同類藥物相差較大以及初步MIC折點與同類藥物不同的藥物，需進行預實驗確定紙片藥物濃度。選

24、擇2-3種濃度紙片，按紙片擴散法標準操作規(guī)程，對總共100株不同種類目標細菌測定抑菌圈直徑，選擇達到以下要求的濃度作為該藥物的紙片濃度。A. 對于敏感菌株，抑菌圈直徑應>15mm, <45mm；B. 對于耐藥菌株，抑菌圈直徑很小或沒有；C. 紙片敏感折點應落在15mm25mm之間。2菌種與菌株數(shù)方案一：測定各種細菌至少500株，其中大部分為抗菌譜所覆蓋菌種。菌株應收集自不同地區(qū)。除非是針對特定菌種的藥物，否則同一種細菌所占比例應20%30%。方案二：按照CLSI和EUCAST分組，對抗菌譜內(nèi)細菌，每組測定100株。抗菌譜較窄的藥物可選擇方案二。3回歸分析以抑菌圈直徑為橫坐標，MIC

25、值為縱坐標做分布散點圖。當所測菌株MIC值在整個測定濃度范圍內(nèi)呈均勻分布時，可直接進行線性回歸，計算相關(guān)性。但對于新藥來說，通常敏感菌占大多數(shù)。這種情況下，需使用誤率分析法（error rate-bounded method）。誤率分析時作為分母的菌株數(shù)量：MIC值在SS+2個稀釋度范圍內(nèi)的菌株（即圖6中陰影部分菌株）或上述全部測定菌株，推薦使用SS+2個稀釋度范圍內(nèi)的菌株。定義不符區(qū)域與不符率（圖6）：由MIC敏感折點和紙片敏感折點（即橫豎2條實線）可將圖6劃分為4個區(qū)域。右上方MIC不敏感而抑菌圈敏感的區(qū)域為重大誤差區(qū)（Very Major）；左下方MIC敏感抑菌圈不敏感而的區(qū)域為大誤差區(qū)

26、（Major）。調(diào)整紙片法的折點線以使不符率滿足表1。Very MajorMajorVery MajorMajor圖6 MIC與抑菌圈直徑分布散點圖。百分比以全部菌株為分母計算。表1 不同區(qū)域可接受不符率MIC范圍SS+2個稀釋度范圍內(nèi)菌株為分母全部菌株為分母重大誤差區(qū)大誤差區(qū)重大誤差區(qū)大誤差區(qū) S+2個稀釋度<2%<1.5%SS+1個稀釋度<10%<10%<1.5%<3% S-1個稀釋度<2%<3%4. 建立標準菌株質(zhì)控范圍除制定折點外，新藥還需要制定其對標準菌株的質(zhì)控范圍，以便進行藥敏試驗時知道標準菌株是否失控，進而質(zhì)控藥敏試驗結(jié)果。我們經(jīng)常

27、使用的標準菌株是來自美國國家菌種保藏中心（ATCC）的標準菌株。新藥抗菌譜中所涉及的所有標準質(zhì)控菌株均需建立質(zhì)控范圍。表2建立標準菌質(zhì)控范圍所需數(shù)據(jù)量測試方法實驗室數(shù)量不同廠家培養(yǎng)基數(shù)量不同批號紙片數(shù)量測試天數(shù)重復次數(shù)最少數(shù)據(jù)量紙片擴散法732101420肉湯稀釋法73至少3天10（最多4次/天）210瓊脂稀釋法73210420注意：1，每個實驗室都需要測定3個不同廠家的同一種培養(yǎng)基；2，除試驗的新抗菌藥物外，還需同時選擇同類中相似品種作為對照藥。如沒有同類藥物，則選擇具有相似抗菌譜的藥物作對照。對照藥只需使用1個批號的培養(yǎng)基和紙片，其他同試驗藥。對照藥的結(jié)果必須在質(zhì)控范圍內(nèi)，如果對照藥失控，

28、當天的其他數(shù)據(jù)也需要重復；3，對于稀釋法，每次接種需使用獨立制備的接種液，MIC值低于0.03mg/L的數(shù)據(jù)應舍去，并且避免出現(xiàn)低于敏感折點5個稀釋度的MIC值。結(jié)果分析：統(tǒng)計平均值、標準差、范圍及中位數(shù)。95%的數(shù)據(jù)應該落在建議的范圍內(nèi)，對于稀釋法，此范圍應包含眾數(shù)±數(shù)的稀釋度。理想的質(zhì)控范圍包括3個稀釋度，但有時可以為4個稀釋度（表3）。表3 質(zhì)控范圍的選擇MIC（mg/L）例1例2例30.0300000651500.1210073300.251041101700.5112101000范圍0.060.50.060.50.120.5十、 研究中的注意事項1. 折點研究的特點：一是貫

29、穿抗菌藥物新藥研發(fā)整個過程，二是其分析數(shù)據(jù)均來源與藥物的藥效、藥代、臨床研究。因此研發(fā)單位應盡早了解折點研究相關(guān)內(nèi)容與要求，于各項試驗設(shè)計階段即予以全面考慮。2. 即便經(jīng)過臨床試驗階段的驗證，折點的最終確立還遠未完成。臨床折點考察的是推薦給藥途徑和劑量下藥物與病原菌的關(guān)系，且和感染部位、患者機體應答等相關(guān)。臨床試驗階段，給藥方案較單一，對進入研究的患者有嚴格要求，不利于從適合的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)異常，且對于臨時折點偏低的問題也不易發(fā)現(xiàn)。因此，即便藥物上市后，對折點的驗證仍需持續(xù)進行。3. 折點是對抗菌藥物活性的人為劃分，制定過程中需權(quán)衡其精準性與便捷性，針對不同菌屬/種以及不同給藥方案，獲得適當數(shù)量的

30、折點。十一、 名詞解釋1. 最低抑菌濃度（Minimal Inhibitory Concentration, MIC）：體外抗菌藥物敏感性試驗中，抑制培養(yǎng)基內(nèi)病原菌生長所需的最低藥物濃度。2. 殺菌曲線（Time-kill Curves）：反映抗菌藥物對細菌殺滅程度隨時間變化的曲線。常指靜態(tài)殺菌曲線，即固定一系列抗菌藥物濃度，觀察細菌與抗菌藥物混合后在不同時間點的菌落數(shù)。以時間為橫坐標，logCFU/ml為縱坐標繪制殺菌曲線。根據(jù)曲線還可以計算殺菌速率，分析殺菌速率隨濃度的變化。3. 抗生素后效應(Post-antibiotic Effects PAE)：細菌暴露于抗菌藥物后，在去除抗菌藥物的

31、情況下恢復生長，處于對數(shù)生長期時菌落數(shù)增加1個log值所需要的時間與對照菌相應時間之差。0.5小時，即該抗菌藥物具有PAE。4. 藥物代謝動力學（Pharmacokinetics，PK，簡稱藥代動力學）：定量描述藥物在機體內(nèi)吸收(absorption)、分布(distribution)、代謝(metabolism)和排泄(excretion)的過程及藥物濃度隨時間動態(tài)變化的規(guī)律，可概括為ADME過程。反映ADME過程的主要PK參數(shù)包括：血藥高峰濃度(Cmax)、達峰時間(Tmax)、藥時曲線下面積(AUC)、表觀分布容積(V)、藥物清除率(CL)、表觀分布容積和末端相消除半衰期(T1/2)等。

32、5. 藥效學（Pharmacodynamics，PD）：指藥物效應的大小隨時間的變化過程。對抗菌藥物而言，是指藥物在體外或體內(nèi)抑制病原菌生長和復制(抑菌)或致病原菌細胞死亡(殺菌)的作用。主要藥效學參數(shù)包括抗菌藥物對細菌的最低抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC)、抗生素后效應(PAE)、亞抑菌濃度下的抗生素后效應(postantibiotic sub/MIC effect，PA/SME)和防突變濃度(mutation prevention concentration，MPC)等。6. 群體藥物代謝動力學（Population Pharmacokinetics，PPK）：指將經(jīng)典的藥代動力

33、學模型與群體統(tǒng)計學模型(population statistical model)結(jié)合，研究藥代動力學特性中存在的變異性，研究藥物體內(nèi)過程的群體規(guī)律、藥代動力學參數(shù)的統(tǒng)計分布及其影響因素。7. 蒙特卡洛模擬（Monte Carlo Simulation，MCS）：考察PK/PD指數(shù)在大量人群中分布規(guī)律的統(tǒng)計試驗方法。首先根據(jù)PK參數(shù)和PD參數(shù)的分布特征進行隨機抽樣，然后將隨機數(shù)值代入公式計算PK/PD指數(shù)，獲知其分布規(guī)律，最終得到PK/PD指數(shù)達到靶值的概率。8. 野生型細菌（Wild-type Bacterial Strains）：最低抑菌濃度不高于流行病學界值的細菌群體，該群體沒有獲得性耐

34、藥及突變耐藥。9. 流行病學界值（Epidemiological Cutoff）：也可稱作野生型界值（Wild-type Cutoff，COWT）或微生物學折點（Microbiological Breakpoint），區(qū)分存在和不存在獲得性耐藥/突變耐藥機制的菌群最低抑菌濃度，通常為野生菌群最低抑菌濃度的上限。10. PK/PD界值（PK/PD cutoff, COPD）：即藥代動力學（PK）和藥效動力學（PD）界值，根據(jù)與臨床療效最為相關(guān)的PK/PD參數(shù)及靶值，模擬獲得達標概率超過90%時的MIC分布范圍上限。11. 敏感（Susceptible, S）：對感染部位使用推薦劑量時，該菌株能被

35、通?？蛇_到的抗菌藥物濃度所抑制。十二、 參考文獻1. Turnidge J and Paterson DL. Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints J. Clinical Microbiology Reviews, 2007, 20: 391-408.2. Turnidge J, Kahlmeter G and Kronvall G. Statistical characterization of bacterial wild-type MIC value distributions and the determination of epidemiological cut-off value J. Clinical Microbiology and Inf