




版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、實(shí)驗(yàn)八實(shí)驗(yàn)八 PCR產(chǎn)品純化及定向克隆產(chǎn)品純化及定向克隆一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握基因工程操作技術(shù)中最常用學(xué)習(xí)并掌握基因工程操作技術(shù)中最常用的的DNA純化和連接方法;鞏固純化和連接方法;鞏固DNA酶切的酶切的操作。操作。 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 PCR產(chǎn)物一般都含有過量的引物、產(chǎn)物一般都含有過量的引物、Taq酶及酶及dNTP等成分,直接影響后續(xù)的基因操等成分,直接影響后續(xù)的基因操作,利用苯酚作,利用苯酚/氯仿、氯仿依次抽提反應(yīng)體氯仿、氯仿依次抽提反應(yīng)體系中的酶,然后在酸性條件下用乙醇沉淀系中的酶,然后在酸性條件下用乙醇沉淀DNA。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)六所用的根據(jù)實(shí)驗(yàn)六所用的PCR引物,其產(chǎn)品
2、的引物,其產(chǎn)品的5和和3末端分別具有末端分別具有EcoR I和和Not I酶切位點(diǎn),酶切位點(diǎn),而載體而載體pET32的多克隆位點(diǎn)中也有此兩個(gè)酶的多克隆位點(diǎn)中也有此兩個(gè)酶切位點(diǎn)。因此,若將切位點(diǎn)。因此,若將PCR產(chǎn)物與載體分別用產(chǎn)物與載體分別用EcoR I和和Not I進(jìn)行雙酶切,所得的產(chǎn)物相進(jìn)行雙酶切,所得的產(chǎn)物相應(yīng)末端正好互補(bǔ),可用應(yīng)末端正好互補(bǔ),可用T4 DNA連接酶在體連接酶在體外進(jìn)行連接。外進(jìn)行連接。正向引物正向引物P1) EcoRI 5-CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3反向引物反向引物P2):): Not I 5-AGAGCGGCCGCCTTT
3、GCCATCATAACTTTGACAAA-3三、實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑三、實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑1、實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)二提取的質(zhì)粒載體實(shí)驗(yàn)二提取的質(zhì)粒載體pET32 實(shí)驗(yàn)七的實(shí)驗(yàn)七的PCR產(chǎn)品以及實(shí)驗(yàn)八的產(chǎn)品以及實(shí)驗(yàn)八的RT-PCR產(chǎn)品產(chǎn)品2、主要試劑、主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶:限制性核酸內(nèi)切酶:EcoR I和和Not I T4 DNA連接酶連接酶 苯酚苯酚/氯仿氯仿/異戊醇、氯仿、醋酸鈉異戊醇、氯仿、醋酸鈉pH5.2)、)、 無水乙醇、無水乙醇、70%乙醇等乙醇等四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟1、PCR產(chǎn)品的純化產(chǎn)品的純化每組同學(xué)的每組同學(xué)的PCR和和RT-PCR產(chǎn)品合并,約產(chǎn)品合并,約130l,
4、轉(zhuǎn)入,轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中,向離心管中,向PCR產(chǎn)品產(chǎn)品中加入中加入150l苯酚苯酚/氯仿氯仿/異戊醇,旋渦混合,異戊醇,旋渦混合,14000 rpm離心離心5 min;將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管,加入將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管,加入150l氯仿,氯仿,旋渦混合,旋渦混合,14000 rpm離心離心5 min;再將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管,加再將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管,加10l醋酸醋酸鈉和鈉和250l無水乙醇,混勻后,離心管插無水乙醇,混勻后,離心管插入冰中放置入冰中放置 30 min; 在在4下下14000 rpm離心離心10 min,去除上清,去除上清,觀察觀察DNA沉淀。沉淀。加加20l滅菌
5、水溶解滅菌水溶解DNA,備用。,備用。四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟2、PCR產(chǎn)品與載體產(chǎn)品與載體pET32的雙酶切的雙酶切 分別在兩個(gè)分別在兩個(gè)1.5mL離心管中準(zhǔn)備雙酶切反應(yīng)離心管中準(zhǔn)備雙酶切反應(yīng)混合液?;旌弦骸. 10 H buffer 5l B. 10 H buffer 5l 0.1% BSA 5l 0.1% BSA 5l EcoR 2l EcoR 2l Not 2l Not 2l PCR產(chǎn)品產(chǎn)品 20l pET32載載體體 約約2g 滅菌蒸餾水滅菌蒸餾水 16l 加滅菌蒸餾水加滅菌蒸餾水至總體積至總體積50l 將上述兩個(gè)離心管內(nèi)的混合物輕輕混勻,將上述兩個(gè)離心管內(nèi)的混合物輕輕混勻,37水
6、浴酶切水浴酶切3小時(shí)。小時(shí)。四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟3、酶切產(chǎn)品的純化、酶切產(chǎn)品的純化 酶切后的酶切后的PCR產(chǎn)品和載體合并產(chǎn)品和載體合并 (約約100l ),加,加入入100l苯酚苯酚/氯仿氯仿/異戊醇,旋渦混合,異戊醇,旋渦混合,14000 rpm離心離心5 min;將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管,加入將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管,加入100l氯仿,氯仿,旋渦混合,旋渦混合,14000 rpm離心離心5 min;再將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管,加再將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管,加10l醋酸鈉醋酸鈉和和250l無水乙醇,混勻后,離心管插入冰無水乙醇,混勻后,離心管插入冰中放置中放置 30 min; 在在4下下
7、14000 rpm離心離心10 min,去除上清;,去除上清;加入加入500l 70%乙醇洗滌乙醇洗滌DNA沉淀,在沉淀,在4下下14000 rpm離心離心5min,去除上清,空氣干燥;,去除上清,空氣干燥;加加8l滅菌水溶解滅菌水溶解DNA,備用。,備用。四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟 4、目的基因、目的基因(CaM5)與載體與載體(pET32)的連接的連接 在滅菌的在滅菌的PCR管中依次加入:管中依次加入: 10 T4 DNA Ligase buffer 1l T4 DNA Ligase 1l PCR產(chǎn)品和產(chǎn)品和pET32 8l 將混合物輕輕混勻,將混合物輕輕混勻,16連接過夜。連接過夜。第二天,從第二天,從PCR儀中取出連接產(chǎn)
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 盤扣式腳手架安全技術(shù)規(guī)范
- 2025年小學(xué)數(shù)學(xué)應(yīng)用題(雞兔同籠)解題技巧實(shí)戰(zhàn)挑戰(zhàn)卷
- 2025年日語能力考試N1級(jí)語法難點(diǎn)突破模擬試卷(附接續(xù)總結(jié)與語法運(yùn)用技巧)
- 2025年金融法律類考試押題沖刺:證券公司監(jiān)督管理法全真模擬試卷
- 2025年考研數(shù)學(xué)(三)線性代數(shù)與概率題型解析與解題技巧實(shí)戰(zhàn)卷
- 2025年高壓電工考試題庫操作技能模擬試題集(中級(jí))
- 肋骨骨折病人護(hù)理常規(guī)
- 創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)的組建與管理
- SAT考試歷史文獻(xiàn)閱讀:2025年獨(dú)立宣言與聯(lián)邦黨人文集深度閱讀試卷
- 2025年智能汽車應(yīng)用工程師職業(yè)技能認(rèn)證模擬試卷(智能駕駛技術(shù)與應(yīng)用)-案例分析篇
- 醫(yī)療器械網(wǎng)絡(luò)銷售質(zhì)量管理規(guī)范宣貫培訓(xùn)課件2025年
- SL631水利水電工程單元工程施工質(zhì)量驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)第1部分:土石方工程
- DL∕T 5370-2017 水電水利工程施工通 用安全技術(shù)規(guī)程
- 廣東省2024年中考數(shù)學(xué)試卷【附真題答案】
- (高清版)TDT 1075-2023 光伏發(fā)電站工程項(xiàng)目用地控制指標(biāo)
- 監(jiān)控立桿基礎(chǔ)國家標(biāo)準(zhǔn)
- 德魯克的績效觀
- 那洛巴尊者傳
- 包材產(chǎn)品HACCP計(jì)劃
- SAP_PS-PS模塊配置和操作手冊(cè)
- 煤矸石綜合利用填溝造地復(fù)墾項(xiàng)目可行性研究報(bào)告-甲乙丙資信
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論