口腔鱗狀細(xì)胞癌基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)及其與血管生成的關(guān)系

1、口腔鱗狀細(xì)胞癌基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)及其與血管生成的關(guān)系    【摘要】  目的探討口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）發(fā)生、發(fā)展過程中基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）對微血管生成的意義。方法采用免疫組化SP法對65例OSCC、40例非典型增生、22例正?？谇火つみM(jìn)行MMP9、CD34免疫組化染色。檢測OSCC、非典型增生、正?？谇火つぶ蠱MP9的表達(dá)和微血管密度（MVD），并分析MMP9的表達(dá)與MVD之間，以及它們與OSCC臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果OSCC組中MMP9的表達(dá)與MVD值均高于非典型增生組，在非典型增生組中均高于正常口腔黏膜組；OSCC組、非

2、典型增生組和正常口腔黏膜組中MMP9表達(dá)與MVD有正相關(guān)趨勢；MMP9的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，MVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。結(jié)論MMP9可能是OSCC的重要促血管生成因子之一?！娟P(guān)鍵詞】  口腔鱗狀細(xì)胞癌免疫組織化學(xué)基質(zhì)金屬蛋白酶9CD34Correlation between Expression of Matrix Metalloproteinase9 and Angiogenesis in Oral Squamous Cell CarcinomaAbstract: Purpose To study the significance of matrix metallo

3、proteinases9 (MMP9) on micro angiogenesisin carcinogenesis and progression of oral squamous cell carcinoma (OSCC). MethodsMMP9 and CD34 were detected by immunohistochemistry SP method in 22 cases of normal oral mucosa, 40 cases of atypical hyperlasia and 65 cases with OSCC. The expression of MMP9 an

4、d microvessel density (MVD) were detected in the three groups and the relationship between expression of MMP9 and MVD and its relationship with OSCC clinicpathological characteristics were reviewed.Results The expression of MMP9 and the level of MVD in OSCC were significantly higher than that in aty

5、pical hyperlasia. The expression of MMP9 and the level of MVD in the group of atypical hyperlasia were significantly higher than that in normal oral mucosa. The expression of MMP9 were closely related with MVD in the tumor group, atypical hyperlasia group and normal oral mucosa group. MMP9 expressio

6、n in OSCC was significantly associated with lymph node metastasis and tumor size. MVD in OSCC was significantly associated with lymph node metastasis. Conclusion MMP9 may be one of important factors in angiogenesis ofOSCC.Key words: oral squamous cell carcinoma; immunohistochemistry; matrix metallop

7、roteinases9; CD34腫瘤內(nèi)新生血管的生成是影響腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的重要因素，近年來的研究表明1基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）在腫瘤血管生成中有重要作用，明膠酶是MMPs的一個亞類，包括基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9），其中MMP9與腫瘤血管生成的關(guān)系研究較少，研究結(jié)果也不一致，有關(guān)口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）組織中MMP9與腫瘤血管生成的關(guān)系，更少見報(bào)道。本研究通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中MMP9和CD34的表達(dá)，并對MMP9的表達(dá)與微血

8、管密度（MVD）做定量分析，探討口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中MMP9對血管生成的作用及其臨床意義。1 材料與方法1.1 資料來源本研究所用石蠟包埋組織標(biāo)本選自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1998年1月至2001年12月的手術(shù)患者?？谇击[狀細(xì)胞癌患者65例，均為作口腔鱗狀細(xì)胞癌根治性手術(shù)的患者，術(shù)前未作放療或化療，術(shù)后經(jīng)病理診斷確診為口腔鱗狀細(xì)胞癌，男性35例，女性30例，中位年齡45.5歲；腫瘤最大直徑3cm者35例，>3cm者30例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者34例；臨床分期為期15例，期28例，期15例，期7例；其中高分化鱗癌18例，中分化鱗癌24例，低分化鱗癌23例。口腔非典型增生病

9、例40例，來自其他口腔疾患手術(shù)標(biāo)本，正常口腔黏膜22例，取自活檢標(biāo)本，均未做過任何治療。1.2 方 法鼠抗人MMP9多克隆抗體和CD34單克隆抗體，免疫組化SP試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。 所有組織均經(jīng)10%甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋， 包埋組織標(biāo)本作4m連續(xù)切片，免疫組化SP法染色參照試劑說明書進(jìn)行， MMP9、CD34均采用高溫直接煮沸法修復(fù)抗原。用已知的陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。1.3 結(jié)果判定MMP9以實(shí)質(zhì)細(xì)胞胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色顆粒判斷為陽性著色。定量及圖像分析采用同濟(jì)醫(yī)大千屏影像公司HPLAS1000病理圖像分析系統(tǒng),將切片

10、上的陽性染色信號轉(zhuǎn)為灰度進(jìn)行分析。MVD計(jì)數(shù)，參照Weinder2報(bào)道的方法進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，先在低倍鏡（×100）下觀察確定血管密度最高處，在（×200）視野下選擇3個高血管密度區(qū)，計(jì)算單位視野（×200）平均血管數(shù)。單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，均作為一個血管計(jì)數(shù)，而直徑大于約8個紅細(xì)胞的血管，有厚肌壁的血管以及硬化區(qū)的血管不在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn)。2 結(jié) 果2.1 MMP9在正?？谇火つそM織、非典型增生、OSCC中的表達(dá)和分布MMP9陽性細(xì)胞胞漿或胞膜呈棕黃色，偶爾可見細(xì)胞核著色，陽性顆粒多

11、呈團(tuán)塊狀。MMP9在癌組織中于腫瘤細(xì)胞(見圖1)、增生上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均有陽性表達(dá)，在血管平滑肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞上也有明顯陽性表達(dá)(見圖2)，MMP9陽性分布呈異質(zhì)性，陽性細(xì)胞多位于癌巢邊緣和管腔周圍，其中基底膜附近的腫瘤細(xì)胞染色尤為明顯。MMP9在非典型增生的表達(dá)主要位于增生上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中，在間質(zhì)細(xì)胞中偶見染色。MMP9在正常口腔黏膜組織表達(dá)微弱，僅見于少數(shù)上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中。對切片的MMP9染色進(jìn)行灰度分析，結(jié)果顯示從正常口腔黏膜，非典型增生到OSCC， MMP9的表達(dá)逐漸增高，OSCC組中MMP9表達(dá)顯著高于非典型增生組織（P<0.05），非典型增生組中MMP9表達(dá)顯著高于正常

12、口腔黏膜（P<0.05），見表1。 MMP9在瘤徑>3cm組中的表達(dá)顯著高于瘤徑3cm組（P<0.05），在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P<0.05），而與腫瘤的分化程度、臨床分期無關(guān)（見表2）。2.2 正?？谇火つそM織、非典型增生、OSCC中MVD的分布CD34標(biāo)記的微血管呈點(diǎn)狀分布，血管內(nèi)皮細(xì)胞膜被染成褐色。腫瘤組織中的微血管形態(tài)不規(guī)則，部分血管呈現(xiàn)發(fā)芽狀，血管分布不均勻，在腫瘤的邊緣區(qū)域最為密集，呈簇狀(見圖3)。非典型增生組織中微血管形態(tài)較規(guī)則，但分布不均，血管簇偶見。正常口腔黏膜組織內(nèi)的微血管形態(tài)規(guī)則，分布均勻。OSCC組中MVD顯著高于非典型

13、增生組織（P<0.05），非典型增生組中MVD顯著高于正?？谇火つぃ≒<0.05），見表1。OSCC中MVD在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P<0.05）， MVD與腫瘤的大小、分化程度、臨床分期無關(guān)（見表2）。2.3 OSCC中MMP9表達(dá)與OSCC血管生成的關(guān)系OSCC中MMP9表達(dá)與MVD顯著高于非典型增生組（P<0.05），非典型增生組MMP9表達(dá)與MVD顯著高于正常口腔黏膜（P<0.05），OSCC組、非典型增生組和正?？谇火つそM中MMP9表達(dá)與MVD呈正相關(guān)趨勢（見表2）。3 討 論腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是多步驟過程。實(shí)驗(yàn)表明3腫瘤組織中微血管

14、密度越大，腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)及淋巴循環(huán)的機(jī)會越多，淋巴結(jié)及鄰近臟器轉(zhuǎn)移的機(jī)會也增大。MMP9由結(jié)締組織細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞分泌，是降解型膠原最主要的酶，在生理情況下維持細(xì)胞外基質(zhì)，在胚胎發(fā)育、組織塑形中起著不可替代的作用。在病理情況下，MMP9通過降解細(xì)胞外基質(zhì)成分中的型膠原使得腫瘤細(xì)胞突破原發(fā)部位正常的基底膜而發(fā)生浸潤，突破脈管周圍的基底膜進(jìn)入脈管系統(tǒng)，即發(fā)生轉(zhuǎn)移。近來研究表明1，4，MMP9不僅是降解基底膜和ECM的關(guān)鍵酶，而且在腫瘤間質(zhì)血管生成中起重要作用。本研究結(jié)果顯示從正?？谇火つ?，非典型增生到OSCC，MMP9的表達(dá)逐漸增高，在非典型增生MMP9的表達(dá)主要位于增生上皮細(xì)胞的胞質(zhì)

15、中，在癌組織中MMP9在腫瘤細(xì)胞，增生上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均有陽性表達(dá)，在表達(dá)的強(qiáng)度、陽性細(xì)胞的種類、數(shù)量上均高于非典型增生組，提示MMP9可能在OSCC發(fā)生中發(fā)揮作用。同時(shí)觀察到并非所有腫瘤細(xì)胞均能表達(dá)MMP9，具有MMP9表達(dá)能力的腫瘤細(xì)胞多位于這部分細(xì)胞多位于腫瘤的外周部分和毛細(xì)血管淋巴管腔周圍，呈片狀、灶狀分布，提示表達(dá)MMP9的細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力，符合腫瘤細(xì)胞的侵襲規(guī)律。在本實(shí)驗(yàn)中還觀察到，在毛細(xì)血管腔和淋巴管腔周圍及管腔內(nèi)部可見聚集成團(tuán)狀并深度著色的癌細(xì)胞，可能為遷移到該處的高轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞克隆增殖而成。另外表達(dá)MMP9的腫瘤細(xì)胞附近的血管平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞上也有明顯陽性表達(dá)

16、，提示該區(qū)域的血管平滑肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞在MMP9的表達(dá)上存在著聯(lián)系，分析結(jié)果顯示MMP9在瘤徑>3cm組中的表達(dá)高于瘤徑3cm組，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示MMP9可能是OSCC侵襲和轉(zhuǎn)移的重要促進(jìn)因素。本實(shí)驗(yàn)中顯示從正常組織非典型增生OSCC，組織中的MVD有逐漸增加趨勢，非典型增生組中的MVD顯著高于正常組，提示細(xì)胞在未發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化之前已有血管生成增多，這一現(xiàn)象是否為OSCC血管生成的啟動階段有待于作進(jìn)一步研究。Eisma等5對頭頸部鱗癌研究發(fā)現(xiàn)MVD每增加10個，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)度就增加1.32倍，在本研究中顯示OSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中MVD顯著高

17、于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，由于在OSCC中發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)會遠(yuǎn)高于血行轉(zhuǎn)移，提示對OSCC原發(fā)灶MVD檢測有利于作出轉(zhuǎn)移和預(yù)后優(yōu)劣的判斷，但是否能作為OSCC的一個獨(dú)立預(yù)后因素尚需要做進(jìn)一步研究。大量研究顯示MMPs與腫瘤血管生成關(guān)系密切，在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察發(fā)現(xiàn)MMP9的表達(dá)部位與MVD高密度區(qū)具有一致性，均位于腫瘤細(xì)胞生長活躍的癌巢邊緣地區(qū)，提示：腫瘤在局外浸潤生長的過程中，新生血管化是同步進(jìn)行的；MMP9的表達(dá)與腫瘤血管形成有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中我們還觀察到MMP9不僅在腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，在腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞上MMP9也有表達(dá)，這與MMP9參與腫瘤新生血管形成的觀點(diǎn)一致。有研究顯示6腫瘤的

18、新生血管內(nèi)皮細(xì)胞可以通過分泌MMP9降解周圍基質(zhì)，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，使自身的血管條索延長和擴(kuò)大，也有研究顯示7,8血管生成因子VEGF在促進(jìn)腫瘤內(nèi)新生血管形成的同時(shí)，可以通過不同的信號途徑，促進(jìn)MMP9的表達(dá)并對TIMP1的表達(dá)進(jìn)行抑制。 這些研究說明MMP9通過多種途徑對腫瘤新生血管形成起作用，總體上表現(xiàn)出促進(jìn)作用。本研究結(jié)果表明 OSCC中MMP9的表達(dá)顯著高于非典型增生，其MVD也顯著高于非典型增生 ，MMP9的表達(dá)與MVD具有一致性，MMP9與腫瘤新生血管形成關(guān)系密切。本研究結(jié)果表明MMP9、新生血管形成與OSCC發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，MMP9可能是OSCC的重要促血管生成因子之

19、一。阻斷MMP9的表達(dá)，抑制MMP9的活化可能具有抑制OSCC轉(zhuǎn)移和血管生成的雙重意義。【參考文獻(xiàn)】1 Guttman D,Stem Y, Shpizer T, et al Expression of MMP9, TIMP1, CD34 and factor8 as prognostic markers for squamous cell carcinoma of the tongueJ. Oral Oncol, 2004,40(8):798-803.2 Weidner N. Current pathologic methods for measuring intratumoral micro

20、vessel density in breast carcinoma and other solid tumorsJ. Breast Cancer Res Treat, 1995,36:169-180.3 Takes RP, Batenburg De, Jong RJ, et al. Markers for nodal metastasis in head and neck squamous cell cancerJ. Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 2002,128(5):512-5184 Nagakaya Y,Aoki T,Kasuya K, et al. Histologic features of venous invasion, expression of vascular endothelial growth factor and matrix metalloproteinase2 and matrix metalloproteinase9, and the relation with liver meta