人的 紅細(xì)胞補(bǔ)體受體1(CR1)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒

1、Uscn Life Science Inc. Wuhan網(wǎng)址: 電話: +86 27 84259552傳真: +86 27 84259551E-mail: uscnk人的紅細(xì)胞補(bǔ)體受體1(CR1酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒使用說明書產(chǎn)品編號:E1123Hu規(guī)格:96T本試劑盒僅供體外研究使用,不用于臨床診斷!預(yù)期應(yīng)用本酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒運用雙抗體夾心ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中CR1含量。本試劑盒已提供的試劑試劑名稱數(shù)量試劑名稱數(shù)量96孔板(預(yù)包被 1 96孔板覆膜 4標(biāo)準(zhǔn)品(凍干 2 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1 × 20ml檢測溶液A (綠色 1 × 120l

2、 檢測稀釋液A(2 x 1 × 6ml檢測溶液B (紅色 1 × 120l 檢測稀釋液B(2 x 1 × 6mlTMB底物 1 × 9ml 終止液 1 × 6ml濃洗滌液(30 x 1 × 20ml 使用說明書 1本試劑盒未提供但需自備的設(shè)備及試劑1、450±10nm濾光片的酶標(biāo)儀(建議儀器使用前提前預(yù)熱2、單道和多道微量加液器及吸頭3、稀釋樣品的EP管4、蒸餾水或去離子水5、吸水紙6、盛放洗液的容器試劑盒的儲存及有效期所有試劑均按試劑瓶標(biāo)簽上所示保存。請注意,收到試劑盒后請盡快將標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A、檢測溶液B以及96孔板保

3、存于-20。開封后的酶標(biāo)板要密封加干燥劑后保存于-20,避免潮濕。有效期為6個月。 實驗原理將CR1抗體包被于96孔微孔板中,制成固相載體,向微孔中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本,其中的CR1與連接于固相載體上的抗體結(jié)合,洗板之后加入生物素化的CR1抗體,將未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后,加入HRP標(biāo)記的親和素,再次徹底洗滌后加入底物(TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CR1呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(值,計算樣品濃度。標(biāo)本的采集與保存1、血清:將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置30分鐘或4過夜,然后1000g離心2

4、0分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20或-80保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。2、血漿:用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2 - 81000g離心15分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20或-80保存,但應(yīng)避免 反復(fù)凍融。3、其它生物標(biāo)本:請1000g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20或-80保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注意: 1、以上標(biāo)本均需密封保存,4保存應(yīng)小于1周,-20不應(yīng)超過1個月,-80不應(yīng)超過2個月。2、標(biāo)本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫,不應(yīng)加熱使之融解。3、標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。試劑準(zhǔn)備1、使用前將所有的試劑

5、和標(biāo)本緩慢均衡至室溫(18-25,試劑不能直接在37溶解。2、標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品:每瓶標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋至1mL,蓋好后室溫靜置大約10分鐘,同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,其濃度為2,000 pg/mL(貯液。先將其稀釋為1,000 pg/mL (標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度后,再準(zhǔn)備7個稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP管,每個EP管中加入500的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,如圖所示依次倍比稀釋成1,000 pg/mL,500 pg/mL, 250 pg/mL,125 pg/mL,62.5 pg/mL,31.2 pg/mL,15.6 pg/mL,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(0 pg/mL直接作為空白孔。為保證實驗結(jié)果有效性,每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品

6、溶液。 Tube 1 2 3 4 5 6 7 8 9pg/mL 2,000 1,000 500 250 125 62.5 31.2 15.6 03、標(biāo)本:血清或血漿標(biāo)本推薦稀釋大約200-500倍,標(biāo)本使用0.02 M 的PBS稀釋( PH=7.0-7.2。4、檢測稀釋液A及檢測稀釋液B:用6mL蒸餾水或去離子水將6mL濃檢測液A及B稀釋至12mL,進(jìn)行2倍稀釋,稀釋后的工作液不宜進(jìn)行冷凍保存。5、檢測溶液A及檢測溶液B:Detection A 及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理,以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。臨用前分別以檢測稀釋液A或B1:100稀釋(如:10 檢測溶

7、液A / 990檢測稀釋液A,充分混勻,稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制(100/孔,實際配制時應(yīng)多配制 0.1-0.2mL。6、濃洗滌液:用580mL蒸餾水或去離子水將20mL濃洗滌液稀釋至600mL,進(jìn)行30倍稀釋。7、底物溶液:請用滅菌的移液器吸頭吸取所需體積的TMB至另一干凈容器中使用,容器中剩余的底物應(yīng)予丟棄,不要倒回TMB瓶中。注意: 1、標(biāo)準(zhǔn)品請于臨用前15分鐘內(nèi)配制。該標(biāo)準(zhǔn)品只能使用一次。2、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋不能直接在板中進(jìn)行。3、標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請使用相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆?；靹驎r要輕輕充分混勻,避免起泡。為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確請使用微量吸

8、管,并校準(zhǔn)微量加液器。請依據(jù)所需的量精確配制,盡量不要微量配制(如吸取檢測溶液A 時,一次不要小于10,以避免造成濃度誤差。4、請勿重復(fù)使用已經(jīng)稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液和檢測溶液B工作液。5、濃洗滌液中如有結(jié)晶析出,請先溫育至室溫,輕輕混勻,至到結(jié)晶完全溶解再進(jìn)行配制。操作步驟實驗前應(yīng)預(yù)測標(biāo)本含量,如果標(biāo)本濃度過高,應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行稀釋,使稀釋后的標(biāo)本符合試劑盒的檢測范圍,計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。1、加樣:分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7孔,依次加入100 不同 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(見試劑準(zhǔn)備2?？瞻卓准?100 (見試劑準(zhǔn)備第二步最后一管,余孔加待測樣品100,酶標(biāo)板加上覆膜,

9、37溫育2小時。2、棄去液體,甩干,不用洗滌。3、每孔加檢測溶液A工作液 100(臨用前配制,酶標(biāo)板加上覆膜,37溫育1小時。4、棄去孔內(nèi)液體,每孔用400的洗滌液洗滌,浸泡1-2分鐘,甩干(也可輕拍將孔內(nèi) 液體拍干,重復(fù)洗板3次。最后一次洗滌后,要把孔內(nèi)的洗滌液完全甩干。5、每孔加檢測溶液B工作液(臨用前配制100,加上覆膜,37溫育30分鐘。 6、棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,方法同步驟4。7、每孔加底物溶液90,酶標(biāo)板加上覆膜,37避光顯色(反應(yīng)時間控制在15-25分鐘,不要超過30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色,后3-4孔梯度不明顯時,即可終止。8、每孔加終止溶液50,終止

10、反應(yīng),此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一,請輕輕晃動酶標(biāo)板以使溶液混合均勻。9、在確保酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后,立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度(值。注意: 1、試劑準(zhǔn)備:準(zhǔn)備一次實驗所需要的酶標(biāo)條,其它的可從微孔板上拆下,密封,按照說明書要求保存,以備下次使用。2、加樣:實驗操作中請使用一次性的吸頭,避免交叉污染。加樣時注意不要有氣泡,將樣品加于酶標(biāo)板底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。加樣或加試劑時,第一個孔與最后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,將會導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時間,從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。因此,一次

11、加樣時間(包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品最好控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實驗。3、溫育:為防止樣品蒸發(fā),實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi),以避免液體蒸發(fā),洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài),同時應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時間和溫度。4、洗滌:充分的洗滌非常重要,在每次洗滌過程中,都要將洗滌液完全甩干。洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干,勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,同時要消除板底殘留的液體和手指印,避免影響最后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。5、反應(yīng)時間的控制:加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如,每隔10分鐘觀察一次,如顏色較深,請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),避免反應(yīng)過強(qiáng)從

12、而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。6、底物:底物請避光保存,在儲存和溫育時避免強(qiáng)光直接照射。洗板方法1、手工洗板方法:將推薦的洗滌緩沖液至少0.4mL注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,吸去(不可觸及板壁或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。2、自動洗板:如果有自動洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。計算各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本值扣除空白孔值后作圖(七點圖,如設(shè)置復(fù)孔,則應(yīng)取 其平均值計算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo),值為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo),在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(最佳方程式應(yīng)依回歸方程計算的R2值來定,以R2值越趨近于1為好。推薦使用專業(yè)制作曲線軟

13、件進(jìn)行分析,如curve expert 1.3,根據(jù)樣品值,由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,將樣品的值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣 品的實際濃度。檢測范圍:15.6 pg/mL - 1,000 pg/mL最低檢測限:4.1 pg/mL此值為20個空白樣品(即標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液測定的平均值加三倍標(biāo)準(zhǔn)差所對應(yīng)的濃度。特異性本試劑盒用于檢測人的CR1,靈敏度高,特異性好,且與其它相關(guān)蛋白無明顯交叉反應(yīng)。典型數(shù)據(jù)為了便于計算,盡管濃度為自變量而O.D.值為因變量,我們繪圖時仍采用標(biāo)準(zhǔn)品的O.D.值作為橫坐標(biāo)(X軸,標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱

14、坐標(biāo)(Y軸。同時為了試驗結(jié)果的直觀性,圖中提供的是原始數(shù)據(jù)而非對數(shù)值。推薦使用對數(shù)值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。由于實驗操作條件的不同(如操作者、移液技術(shù)、洗板技術(shù)和溫度條件等,標(biāo)準(zhǔn)曲線的O.D.值會有所差異。所提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供參考,實驗者需要根據(jù)自已的實驗建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。 圖1:人的紅細(xì)胞補(bǔ)體受體1(CR1試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線說明 1、由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析,本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險。2、最終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當(dāng)時的實驗環(huán)境密切相關(guān),請務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。3、本試劑盒不能排除標(biāo)本中可能含有的可溶性受體,配體,結(jié)合蛋白和其它相關(guān)因子對實驗所產(chǎn)生的干擾。4、只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果,因為所有試劑都是有關(guān)聯(lián)的,不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到最佳的檢測結(jié)果。5、在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染,因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。6、剛開啟的酶聯(lián)板孔