弱酸樹脂D113對(duì)S_腺苷_L_蛋氨酸的交換行為及分離應(yīng)用研究

1、離子交換與吸附, 2003, 19(2: 104 110 ION EXCHANGE AND ADSORPTION 文章編號(hào)：1001-5493(200302-0104-07弱酸樹脂D113對(duì)S-腺苷-L-蛋氨酸的交換行為及分離應(yīng)用研究*劉 惠 林建平 岑沛霖*浙江大學(xué)(玉泉 材化學(xué)院生物工程研究所，杭州 310027摘要：考察了S-腺苷-L-蛋氨酸 (S-adenosyl-L-methionine, SAM 在弱酸樹脂爭(zhēng)光D113上的靜態(tài)吸附及分離行為，利用Langmuir 等溫式對(duì)平衡等溫線進(jìn)行了擬合，實(shí)驗(yàn)表明，隨著pH 的提高，平衡交換量增加，提高溫度和SAM 的初始濃度在一定程度上能促進(jìn)

2、內(nèi)擴(kuò)散過程，利用D113樹脂在 1.730.0cm 小型柱上從酵母提取液中分離SAM 的得率為90%以上，純度達(dá)87%以上。 關(guān)鍵詞：S-腺苷-L-蛋氨酸 (SAM，AdoMet 或SAM-e 弱酸樹脂 離子交換 酵母 分離 中圖分類號(hào): TQ028 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A1 前 言體內(nèi)廣泛存在的小分子。對(duì)關(guān)節(jié)病療效顯著，O是一種有效的抗抑郁藥，利于肝病患者的康13。分子量為399，分子結(jié)構(gòu)見Fig 1。 復(fù)一般采用從酵母細(xì)胞中提取的方法生產(chǎn)簡(jiǎn)稱SAM ，AdoMet 或SAM-e ），是一種生物SAM ，在其溶液的pH 值及常溫下，SAM 會(huì)發(fā)4生各種降解及硫原子上的手性異構(gòu)反應(yīng)，工S-腺苷-L-

3、蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine,2C H C H 2 Fig. 1 Structure of S-adenosyl-L-methionine業(yè)生產(chǎn)中存在的主要問題是SAM 的不穩(wěn)定特點(diǎn)以及其復(fù)雜的分離純化過程。Presence of the high energy sulfonium ion activateseach of the attached carbons towardnucleophilic attack文獻(xiàn)中一般利用選擇性沉淀劑如苦酮酸、Reinack 鹽、苦味酸、磷鎢酸鹽等沉淀SAM ，5與其他雜質(zhì)如核酸、蛋白類等分離，工藝中有機(jī)溶劑的用量較大。SAM

4、分子除具有一帶正電荷的極性較強(qiáng)的锍基，還有3個(gè)可離子化的基團(tuán)6用陽離子樹脂進(jìn)行交換分離。5：氨基酸鏈上的氨基和羧基p K a分別為7.8和1.8，嘌呤上的氨基p K a 為3.4，酸性條件下氨基質(zhì)子化后帶正電荷，可以利* 收稿日期：2002年8月18日作者簡(jiǎn)介： 劉 惠, 女(1975, 山東省人, 在讀博士研究生. E-mail: lhzju *通信聯(lián)系人第19卷第2期 離 子 交 換 與 吸 附 105SAM 分子具有一定的尺寸，而且?guī)д姾傻娘郴鶚O性較強(qiáng)，適用大孔弱酸樹脂進(jìn)行分離，分離選擇性好，但SAM 的不穩(wěn)定特點(diǎn)需要分離操作在酸性條件下進(jìn)行7，而弱酸樹脂一般適于在堿性或中性體系中使用

5、，否則交換能力較低，本文將主要對(duì)SAM 在D113弱酸樹脂上的靜態(tài)離子交換行為以及分離應(yīng)用特點(diǎn)進(jìn)行考察，為SAM 的工業(yè)化生產(chǎn)做準(zhǔn)備。2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 材料SAM標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma 公司，為SAM 的硫酸和對(duì)甲苯磺酸雙鹽。所用的其它化學(xué)試劑均為分析純。爭(zhēng)光D113樹脂由杭州爭(zhēng)光樹脂廠提供，是一種丙烯酸類弱酸型陽離子交換樹脂，聚合單體為丙烯腈，交聯(lián)劑為TAIC(Trially-1,3,5-triazine-2,4,6-(1H,3H,5H-trione ，其體積交換容量較大，具體性能見表1。2.2 實(shí)驗(yàn)和分析方法 2.2.1 SAM破胞萃取采用本實(shí)驗(yàn)室保存的釀酒酵母 (S. cerevisia

6、e ZJUS1 在富蛋氨酸的基質(zhì)中培養(yǎng)824h 后，利用Sorvall RC5C冷凍離心機(jī)在510下3000r/min離心后收集菌體，SAM 約占菌體干重的3%5%，加入水和乙酸乙酯各0.12L/kg上清液待用，pH 約在2.03.5之間。2.2.2 SAM的定量分析9樣品適當(dāng)稀釋后用HPLC 分析：色譜柱Nova-Pak C18(1503.9mm I.D.；流動(dòng)相40mmol/L NH4H 2PO 4，8mmol/L 1-庚烷磺酸鈉，18%甲醇，pH 用濃鹽酸調(diào)至3.0；流速0.7ml/min；檢測(cè)器波長254nm ，出峰時(shí)間4min 5min。2.2.3 交換容量的測(cè)定全交換容量的測(cè)定：見

7、文獻(xiàn)10所介紹的常規(guī)方法。濕酵母，劇烈攪拌表1 爭(zhēng)光D113樹脂的性能指標(biāo) 分 類樹脂骨架 功能基團(tuán) 出廠形式 含水量 (%質(zhì)量全交換容量 (mmol/g體積全交換容量 (mmol/ml大孔弱酸陽樹脂 丙烯酸系 COO H + 4555 11.0 4.2 0.720.80 1.141.20.3151.25 mm 95 滲磨圓球率 90濕視密度 (g/ml 濕真密度 (g/ml 范圍粒度 (% 機(jī)械強(qiáng)度 (%30min 后，加入0.175mol/L的硫酸溶液0.5L/kg濕酵母，繼續(xù)攪拌1.5h ，5下5000r/min離心30min ，收集106 Ion Exchange and Adsorp

8、tion 2003年4月平衡等溫線測(cè)定：陽離子樹脂按常規(guī)方法轉(zhuǎn)成H +型，抽濾待用，分別稱取0.3g0.5g濕樹脂于50ml 的具塞三角瓶?jī)?nèi)，并取適量烘干稱重，SAM 溶液（純度95%以上，濃度0mg/ml10mg/ml，pH 3.04.0），用濃NaOH 溶液調(diào)至pH 5.0，移取10ml20ml于三角瓶?jī)?nèi)，置于溫控?fù)u床內(nèi)，轉(zhuǎn)速180r/min190r/min，交換8h12h取樣分析。靜態(tài)離子交換動(dòng)力學(xué)過程的測(cè)定：樣品溶液用濃NaOH 溶液調(diào)至需要的pH 值，間隔一定的時(shí)間取樣，其它同上。2.2.4 從酵母萃取液分離SAM離子交換柱（1.730cm ）內(nèi)D113樹脂（H +型）裝柱約50ml

9、 ，水洗平衡20min ，酵母萃取液pH 用濃NaOH 溶液調(diào)至5.0，調(diào)節(jié)適當(dāng)流速（Pharmacia pump-1）進(jìn)樣，用去離子水、乙酸洗脫雜質(zhì)后，采用0.1mol/L硫酸調(diào)節(jié)不同的流速進(jìn)行SAM 洗脫，流出液采用檢測(cè)器（Pharmacia Optical Unit UV-1）與記錄儀（Pharmacia Rec 111）監(jiān)視，并采樣分析。3 結(jié)果與討論3.1 離子交換平衡等溫線通過比較，發(fā)現(xiàn)大孔弱酸型離子交換樹脂爭(zhēng)光D113具有在酸性條件下離子交換SAM 能力較高的特點(diǎn)。在初始pH 5.0時(shí)，SAM 在D113弱酸樹脂上的離子交換平衡如Fig. 2所示，可以采用Langmuir 方程描

10、述：bc q = （1） 1+Kc擬合結(jié)果見Fig 2，實(shí)驗(yàn)測(cè)得D113樹脂的總交換容量為7.67mmol/g 干樹脂，F(xiàn)ig. 2中結(jié)果表明樹脂交換容量的利用率較低。3.2 pH對(duì)離子交換過程的影響Fig. 2 Ion-Exchange Isotherm at T=303.15K with Initial pH 5.0弱酸樹脂的體積交換量隨pH 增加而增加，一般適合在堿性體系中使用。Fig. 3為D113樹脂在不同初始pH 的樣品溶液中的靜態(tài)離子交換過程，而Fig. 4為Fig. 3中對(duì)應(yīng)的平衡交換量與樣品液的初始pH 的關(guān)系，在初始pH 25范圍內(nèi)，隨著初始pH 的增加，由于羧基的解離受p

11、H 影響而增加，平衡交換量也隨pH 增加而增加，而且在離子交換過程中，液相pH 也會(huì)隨著交換量的變化而改變。因此式（1）所示的Langmuir 等溫線由于沒有考慮pH 對(duì)平衡的影響而局限于較窄的pH 范圍。 第19卷第2期 離 子 交 換 與 吸 附 107Fig. 3 The Effect of Initial pH on the StaticIon-Exchange of SAM on D113Fig. 4 pH Effect on Ion-Exchange Amounts onD113 at Equilibrium3.3 溫度對(duì)SAM 在D113樹脂上離子交換的影響當(dāng)初始pH 為5.0，

12、c 0=5.4mmol/L時(shí)，溫度控制在20和30時(shí)SAM 在D113樹脂上離子交換的動(dòng)力學(xué)曲線如Fig 5所示，說明溫度提高將使擴(kuò)散速率加快，而且主要是影響離子交換初期的速度。在離子交換的后期，兩種溫度下的交換曲線幾乎重合，而且平衡交換量隨溫度增加略有降低。Fig. 5 Temperature Effect on Static Ion-ExchangeDynamics of SAM on D113, c 0=5.4 mmol/LFig. 6 The Dynamics of Static Ion-Exchange ofSAM on D113, T=253.4 初始SAM 濃度對(duì)D113樹脂上離

13、子交換速率的影響初始pH 為5.0，25時(shí)，初始濃度分別為10.2mmol/L和2.1mmol/L時(shí)的靜態(tài)離子交換動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見Fig 6，從圖中可以看到，初始SAM 濃度較高時(shí)，最終達(dá)到的離子交換量也比較高。 108 Ion Exchange and Adsorption 2003年4月3.5 應(yīng)用D113樹脂從酵母提取液中分離純化SAMTable 2 Effects of Loading Rates and Amounts on the SAM Yield #(column volume/h(volume ratio (g/L resin elution (volume ratio (%

14、1.5 3.06.83 7.2941.8 44.66.4 7.290.4 69.0在富含蛋氨酸的基質(zhì)中培養(yǎng)酵母細(xì)胞，離心分離獲得濕酵母，先后采用乙酸乙酯與0.175mol/L硫酸處理濕酵母，釋放出胞內(nèi)的SAM ，離心分離出菌體碎片，將離心后的上清液的pH 調(diào)節(jié)至5.0，利用1.730.0 cm小型樹脂柱，D113樹脂裝量50ml ，分別在兩種速率下進(jìn)樣，當(dāng)進(jìn)樣量達(dá)到床層體積的約7倍時(shí)停止進(jìn)樣，先用去離子水洗滌、然后再用0.1mol/L乙酸洗去部分雜質(zhì)以后，以0.1mol/L硫酸洗脫SAM ，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及SAM 得率見Table 2，可以看到當(dāng)進(jìn)樣速率為每小時(shí)1.5倍交換柱體積、進(jìn)樣量為6.83倍

15、交換柱體積時(shí)，SAM 的處理量為41.8g/L resin，經(jīng)過1.730.0cm 小型離子交換柱分離后，SAM 得率達(dá)到了90%以上。當(dāng)進(jìn)樣速率提高到每小時(shí)3.0倍交換柱體積、進(jìn)樣量為7.29倍交換柱體積時(shí)，SAM 的得率迅速下降到了69.0%，這同離子交換需要一定的時(shí)間才達(dá)到平衡的特點(diǎn)相符合。以上結(jié)果表明，較低的進(jìn)樣流速有利于提高SAM 的得率。Fig. 7 HPLC Analysis of SAM Standard Fig. 8 HPLC Analysis of Yeast Cell LysatesFig. 7Fig. 9分別示出了SAM 標(biāo)準(zhǔn)品、離子交換柱進(jìn)樣及硫酸洗脫液的HPLC 圖

16、譜。SAM 的標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 色譜圖中，在3.9min 處為SAM 峰，由于SAM 的不穩(wěn)定易分解特點(diǎn)，前面有一些雜質(zhì)峰，另外，所用的標(biāo)準(zhǔn)品為SAM 的硫酸和對(duì)甲苯磺酸雙鹽，第二個(gè)雜峰對(duì)應(yīng)為對(duì)甲苯磺酸的吸收峰。從進(jìn)樣（Fig 8）的HPLC 分析中知，SAM 的初始濃度為6.4g/L，而且含有大量的雜質(zhì)，純度為約60%（254nm 處吸收峰面積比）。而Fig. 9 顯示的硫酸洗第 19 卷第 2 期 離 子 交 換 與 吸 附 109 脫液的 HPLC 色譜圖表明， 除了保留時(shí)間為 1.5min 處有一較大而平坦的吸收峰外， 只有 一個(gè) SAM 的色譜峰， SAM 純度達(dá)到了 87% （254

17、nm 處吸收峰面積比）以上，進(jìn)一步的 研究表明，雜質(zhì)峰主要是色素類物質(zhì)，使洗 脫溶液呈現(xiàn)明顯的淡黃綠色。 4 結(jié) 論 Fig. 9 HPLC A nalysis of the Collects Eluted by 0.1mol/L Sulfuric A cid 本文主要考察了 SAM 在 D113 弱酸樹 脂上的交換行為以及利用 D113 樹脂從酵母 提取液中分離提純 SAM 的過程。 對(duì) S-腺苷-L-蛋氨酸在國產(chǎn) D113 樹脂上的靜態(tài)離子交換平衡等溫線用 Langmuir 等溫 式進(jìn)行了擬合；初始 pH 對(duì) SAM 在 D113 樹脂上的靜態(tài)離子交換過程及交換平衡有重要的 影響，增加 p

18、H 有利于平衡交換量的增加，但過高的 pH 會(huì)造成 SAM 的降解，在分離過程 中對(duì) pH 的控制是非常必要的；適當(dāng)提高溫度對(duì)離子交換量影響不大，卻能提高初期的離 子交換速率；提高 SAM 的初始濃度能增加 SAM 的交換量，但對(duì)交換速率影響不大。 利用1.730.0cm 小型柱，樹脂裝柱 50ml 時(shí)，從酵母提取液中利用 D113 樹脂柱分離 SAM 的得率為 90%以上，處理量為 41.8g/L resin，純度達(dá) 87%以上。 結(jié)果表明， 利用爭(zhēng)光 D113 弱酸樹脂從酵母提取液中分離 SAM 是一種簡(jiǎn)單有效的分離 方式，處理量、得率以及產(chǎn)品純度都比較高，有望用于工業(yè)生產(chǎn)。 參考文獻(xiàn) 1

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