果蠅S2細(xì)胞中高表達(dá)熒光素酶重組質(zhì)粒的構(gòu)建及活性測定(一)

1、果蠅S2細(xì)胞中高表達(dá)熒光素酶重組質(zhì)粒的構(gòu)建及活性測定(一)    摘要目的：構(gòu)建果蠅S2細(xì)胞中高表達(dá)熒光素酶的重組質(zhì)粒。方法：用PCR方法擴(kuò)增得到pac啟動(dòng)子的基因片段，經(jīng)酶切亞克隆至pGL3Basic的真核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞，通過測定熒光素酶和半乳糖苷酶的活性計(jì)算熒光素酶的相對活性。結(jié)果：構(gòu)建的重組質(zhì)粒在S2細(xì)胞中熒光素酶的相對活性較pGL3Control中增加了2.7萬倍。結(jié)論：成功構(gòu)建了果蠅S2細(xì)胞中高表達(dá)熒光素酶的重組質(zhì)粒pGL3pac。 關(guān)鍵詞果蠅S2細(xì)胞；熒光素酶；啟動(dòng)子；報(bào)告基因；轉(zhuǎn)染 在研究基因功能的過程中，不可避免地要研究基因

2、的調(diào)控機(jī)制，而基因的表達(dá)產(chǎn)物復(fù)雜且難以對其定量和定性，要在細(xì)胞生長周期的任意點(diǎn)了解細(xì)胞的基因表達(dá)產(chǎn)物更是非常困難。但報(bào)告基因分析系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)給基因調(diào)控與表達(dá)的研究帶來了新的希望。近年來，報(bào)告基因系統(tǒng)的研究取得了快速的發(fā)展。報(bào)告基因是一種編碼某種易于檢測蛋白質(zhì)或酶的基因，通過它的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控，因此，對真核基因調(diào)控的了解可以不通過直接測定調(diào)控元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄速率的能力，而是把順式調(diào)控元件與報(bào)告基因的序列連接起來，在基因轉(zhuǎn)錄的過程中測定報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)量，從而判斷相應(yīng)的順式作用元件的調(diào)控能力。作為報(bào)告基因必須具備以下特點(diǎn)：（1）由原核基因編碼的基因產(chǎn)物必須區(qū)別于轉(zhuǎn)染前真核細(xì)胞內(nèi)任

3、何相似的產(chǎn)物；（2）細(xì)胞內(nèi)其他基因產(chǎn)物不會(huì)干擾報(bào)告基因產(chǎn)物的檢測；（3）報(bào)告基因編碼產(chǎn)物的檢測應(yīng)該快速、簡便、靈敏度高、重復(fù)性好。該技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、可信性大及檢測方便且適合大規(guī)模檢測，目前已廣泛應(yīng)用于啟動(dòng)子分析、監(jiān)控轉(zhuǎn)基因及其表達(dá)、細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與藥物的篩選等多種細(xì)胞事件13。熒光素酶（LUC）報(bào)告基因來源于北美螢火蟲，能催化螢火蟲的氧化性羧化作用，同時(shí)發(fā)射出光子，可被光度計(jì)捕獲定量。LUC的分析具有快速、方便、線性較好等優(yōu)點(diǎn)，正成為最廣泛使用的報(bào)告基因。pGL3系列的質(zhì)粒就是帶有LUC報(bào)告基因的質(zhì)粒載體，我們可以利用這一系列的工具載體研究果蠅中基因的表達(dá)調(diào)控方式，其中pGL3Con

4、trol帶有SV40的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。SV40是一種猴病毒， 它的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子區(qū)域可使其在大多數(shù)細(xì)胞株中有高度的組成性表達(dá)，因而廣泛用于構(gòu)建真核基因的表達(dá)載體，因此pGL3Control可作為檢測體系中的陽性對照。但由于SV40啟動(dòng)子在果蠅S2細(xì)胞中不表達(dá)，所以我們將果蠅actin 5C 蛋白的啟動(dòng)子（pac）4構(gòu)建到質(zhì)粒pGL3Basic中，得到了高表達(dá)LUC的重組載體pGL3pac。這一質(zhì)粒的構(gòu)建可為研究果蠅中基因的調(diào)控方式奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也可為研究其他報(bào)告基因在不同細(xì)胞中的表達(dá)提供借鑒作用。1 材料和方法1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑大腸桿菌DH5（作者所在實(shí)驗(yàn)室保存），質(zhì)粒pGL3Basic

5、(Promega公司)，pAc5.1/V5His/LacZ(Invitrogen公司)，限制性內(nèi)切酶Xho、Hind及T4連接酶、DNA聚合酶(TaKaRa公司)，小量膠回收試劑盒(TaKaRa公司)，中量質(zhì)粒抽提試劑盒(Invitrogen公司)，LUC檢測試劑盒(Promega公司)，S2細(xì)胞Schneider培養(yǎng)基(Invitrogen公司)，胎牛血清（Gibco公司）。12 方法1.2.1 pac啟動(dòng)子的獲得 以pAc5.1/V5His/LacZ質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物5GCGCCTCGAGCTTCAAGGAATTAATTCTATATTCT3,下游引物5GCGCAAGCTTG

6、GTCTCTGGATTAGACGACT3（劃線部分分別為Xho和Hind酶切位點(diǎn)）。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 5 min；94 1 min，60 1 min，72 2 min，共30個(gè)循環(huán)； 72 延伸10 min。1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建鑒定與中量抽提純化 PCR產(chǎn)物分別經(jīng)Xho、Hind雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收酶切片段，與同樣經(jīng)酶切、割膠回收的pGL3Basic質(zhì)粒于16 連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，并涂布于含氨芐青霉素（終質(zhì)量濃度為50 mg?L-1）的固體培養(yǎng)基上，37 過夜培養(yǎng)。挑陽性克隆提取質(zhì)粒，酶切和測序鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒經(jīng)中量質(zhì)粒抽提試劑盒提取純化。1.

7、2.3 S2細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 S2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室凍存，使用Schneider培養(yǎng)基，補(bǔ)以10%胎牛血清。S2細(xì)胞培養(yǎng)在28 無CO2培養(yǎng)箱中，根據(jù)其生長狀態(tài)，按一定比例每3 d傳代1次。待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分析。轉(zhuǎn)染時(shí)在12孔板中接種1×106個(gè)細(xì)胞，加入1 ml含10%胎牛血清的Schneider培養(yǎng)基，置28 無CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)616 h細(xì)胞生長至對數(shù)生長期達(dá)（24）×106ml-1，在1.5 ml Eppendorf 管中準(zhǔn)備以下試劑：溶液A,12 l 2 mol?L-1 CaCl2，5 g重組質(zhì)粒,1 g pAcLacZ質(zhì)粒，加入雙蒸水至總體積為10

8、0 l，混勻待用；溶液B,100 l2×HBS。將A溶液緩慢加入B溶液中，輕輕混勻，室溫放置30 min，以形成Ca3PO4DNA復(fù)合物。將Ca3PO4DNA復(fù)合物逐滴加至細(xì)胞上，混勻后置28 無CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后用含10%胎牛血清的Schneider培養(yǎng)基給細(xì)胞換液。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后裂解細(xì)胞，先吸去培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，在每個(gè)培養(yǎng)孔中加入200 l Reporter lysis buffer，保證充分覆蓋細(xì)胞，凍融1次以確保細(xì)胞裂解，將細(xì)胞裂解液移至1.5 ml Eppendorf管中，振蕩1015 s，離心（12 000×g，2 min，4 ），轉(zhuǎn)移

9、上清于新管。制備好的細(xì)胞裂解液可用于測定或貯存于-70 備用。1.2.4 LUC和半乳糖苷酶(gal)活性測定 取制備好的細(xì)胞裂解液進(jìn)行LUC和gal活性的測定。LUC活性測定前取20 l平衡至室溫的細(xì)胞裂解液，加入80 l LUC底物，迅速混勻，置光度計(jì)中，記錄讀數(shù)。gal活性測定根據(jù)分子克隆的方法，在每個(gè)用于測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解物的Eppendorf管中加入100×Mg2+ 3 l、1×ONPG 66 l、細(xì)胞裂解物30 l、0.1 mol?L-1Na3PO4 201 l,混勻。置37 保溫30 min，以500 l 1 mol?L-1 Na2CO3終止顯色反應(yīng)。置酶標(biāo)儀上

10、，在波長420 nm處讀光吸收值來表示gal的活性，以共轉(zhuǎn)化的gal活性作為內(nèi)源對照，以/gal活性的值為系數(shù)，比較各組在轉(zhuǎn)化效率相同時(shí)LUC活性的相互關(guān)系。以沒有任何插入片段時(shí)pGL3Basic的LUC活性為1，比較加上插入片段pac啟動(dòng)子后的LUC活性增加的倍數(shù)，即LUC的相對活性，以反映LUC基因表達(dá)的相對水平。2 結(jié) 果2.1 重組載體的構(gòu)建鑒定與純化以pAc5.1/V5His/LacZ質(zhì)粒為模板，通過上游引物和下游引物PCR擴(kuò)增獲得pac啟動(dòng)子2 500 bp基因片段（圖1），用Xho、Hind雙酶切后克隆到載體pGL3Basic中（圖2）。提取重組陽性質(zhì)粒，Xho、Hind雙酶切后

11、得到2 500 bp的基因片段（圖1）。經(jīng)測序鑒定，閱讀框架不變。鑒定完成的重組質(zhì)粒經(jīng)過質(zhì)粒中量抽提試劑盒提取純化，得到符合轉(zhuǎn)染所需的高純度高濃度的重組質(zhì)粒pGL3pac，經(jīng)測定其260 nm的OD值，計(jì)算得到其濃度為0.99 g?l-1,A260 nm/A280 nm為1.81。2.2 S2細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分析轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，pGL3Basic和pGL3Control中LUC的相對活性無明顯差異，提示SV40啟動(dòng)子在果蠅S2細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)。而pGL3pac中插入了pac啟動(dòng)子，LUC的相對活性明顯增高。pGL3pac在果蠅S2細(xì)胞中LUC的活性是pGL3Basic LUC活性的近2.7萬倍

12、。見表1。表1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后各組分酶活性值 3 討 論LUC是現(xiàn)在常用的一種報(bào)告基因,因其無放射性、檢測快、靈敏度高、半衰期短、線性好等特點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用。我們構(gòu)建了pGL3pac這一重組質(zhì)粒，使得在果蠅S2細(xì)胞中能夠高表達(dá)LUC，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)提供了一個(gè)好的工具。首先，它可作為基因啟動(dòng)子分析研究中的陽性對照,通過與該重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染結(jié)果比較,從而判定不同順式作用元件對轉(zhuǎn)錄的影響。其次，我們可以將目的基因某一區(qū)域的啟動(dòng)子元件插入到重組質(zhì)粒pGL3pac啟動(dòng)子的上游或下游，通過LUC表達(dá)量改變的放大作用，進(jìn)一步分析這些啟動(dòng)子元件的生物學(xué)作用，找到在轉(zhuǎn)錄過程中起到關(guān)鍵作用的核心啟動(dòng)子序列。在此基礎(chǔ)上

13、，我們還可以了解特定的反式作用因子對基因表達(dá)的影響。再次，還可以將目的基因自身的5端或3端的UTR序列插入到LUC基因的上下游，通過檢測LUC的水平，為翻譯水平的調(diào)控提供依據(jù)。在實(shí)驗(yàn)過程中，有很多方面值得我們注意。第一，在重組質(zhì)粒利用中量試劑盒抽提純化時(shí)，想得到濃度高的產(chǎn)物，應(yīng)注意在菌液的培養(yǎng)量和培養(yǎng)時(shí)間上進(jìn)行調(diào)整。因?qū)嶋H環(huán)境的不同，按照操作說明所示的條件往往難以得到足夠的質(zhì)粒量，通過增加培養(yǎng)的菌液量和延長培養(yǎng)時(shí)間可取得很好的效果。由于所得的質(zhì)粒是細(xì)胞轉(zhuǎn)染所需，故在抽提純化時(shí)應(yīng)特別強(qiáng)調(diào)無菌的原則。第二，在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，重組質(zhì)粒pGL3pac必須共同轉(zhuǎn)染表達(dá)另外一帶有報(bào)告基因的質(zhì)粒以衡量轉(zhuǎn)染效率。

14、我們選擇了pAcLacZ，該質(zhì)粒含lacZ基因，能夠表達(dá)gal，利用gal水解底物ONPG的能力計(jì)算出gal的活性，以此作為內(nèi)源對照衡量不同組分的轉(zhuǎn)染效率。這個(gè)質(zhì)粒與目的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染比例對于結(jié)果有很大的影響。因gal的活性在0.20.8之間符合線性范圍,所以可根據(jù)這一要求摸索合適的轉(zhuǎn)染比例，通過實(shí)驗(yàn)可得出兩者在51濃度比時(shí)較合適。另外，還可以選擇帶有其它報(bào)告基因的質(zhì)粒載體，如phRL是一種帶有海腎熒光素酶（RLUC）報(bào)告基因的質(zhì)粒載體，如果選擇phRL作為共轉(zhuǎn)質(zhì)粒則可通過在一管細(xì)胞裂解液中先后加入不同的底物，用同種儀器測定酶的活性即可，因其測定的兩種酶的活性在同一數(shù)量級而且減少實(shí)驗(yàn)步驟，使實(shí)驗(yàn)數(shù)

15、據(jù)更加可靠，實(shí)驗(yàn)過程更加簡便5。第三，我們是通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染得出結(jié)論，為排除一些因素的影響，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)必須重復(fù)3或4次，本實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)即是3次實(shí)驗(yàn)的平均值。在實(shí)驗(yàn)中我們選擇了pac替代pGL3Control中的SV40啟動(dòng)子，主要是因?yàn)楣塧ctin 5C蛋白組在果蠅體內(nèi)為組成性表達(dá)且不需誘導(dǎo)，因此，利用pac作為替換啟動(dòng)子，不僅能產(chǎn)生較好的效果而且可簡化實(shí)驗(yàn)操作。這一質(zhì)粒的構(gòu)建不僅為我們在細(xì)胞水平利用報(bào)告基因系統(tǒng)研究果蠅中基因的表達(dá)調(diào)控方式提供工具載體，而且它的構(gòu)建方法提示我們可通過相同的途徑構(gòu)建適合轉(zhuǎn)染不同類型細(xì)胞的帶有報(bào)告基因的質(zhì)粒載體，作為相應(yīng)研究的基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)1LOUISE H. Re

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