抗p16單克隆抗體的制備及鑒定

1、    抗p16單克隆抗體的制備及鑒定        摘要目的：制備抗p16單克隆抗體并進(jìn)行鑒定。方法:以p16合成肽為抗原免疫純系小鼠。利用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，并利用親和層析等法純化抗體。通過(guò)酶免疫測(cè)定及免疫印 跡等法對(duì)單克隆抗體進(jìn)行分析及鑒定，并通過(guò)免疫組化方法與進(jìn)口多克隆抗體進(jìn)行比較。結(jié)果：獲得4株穩(wěn)定分泌抗p16單克隆抗體雜交瘤株，與進(jìn)口多克隆抗體比較，檢測(cè)陽(yáng)性及陰性 符合率達(dá)100。但使用單克隆抗體時(shí)，組織切片不需進(jìn)行抗原修復(fù)，染色效果穩(wěn)定。結(jié)論：抗p16單克

2、隆抗體的獲得彌補(bǔ)了國(guó)內(nèi)p16檢測(cè)試劑的空白。關(guān)鍵詞p16單克隆抗體多克隆抗體Preparation and Characterization of Monoclonal Antibodies against p16 Wan Wenhui Wang Qing Li Zhenpu et al(School of Oncology, Beijing Medical University, Beijing Cancer Hospital, Beijing)Abstract Objective: To prepare the monoclonal antibodies (McAbs) against p

3、16 and to characterized the McAbs. Methods: Balb/C mice were immunized with polypeptide fragment of p16 as antigen. Hybridoma technique was used to prepare McAbs agaist p16, and affinity chromatography was used to purify the McAbs. The McAbs were analysed and characterized with EIA and Western Blot

4、et al. and were compared with imported polyclonal antibodies (PoAbs). Results: Four hybridoma cell lines which stably secrete McAbs against p16 were got. There was a complete correspondence between the McAbs and imported PoAbs. Conclusion: The McAbs have high specificity and sensitivity. In addition

5、, the prepared monoclonal antibodies against p16 make up the blank space of domestic test reagent. Key Words p16 Monoclonal antibody Polyclonal antibodies ?1994年以來(lái)，關(guān)于p16抑癌基因及其產(chǎn)物在多種腫瘤細(xì)胞株及人腫瘤組織中表達(dá)的研究提 示，p16與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有密切關(guān)系。p16基因失活的最常見(jiàn)形式為純合缺失和DNA 甲基化，其表現(xiàn)形式為p16蛋白缺失1。因此，可用免疫組織化學(xué)(IHC)方法直接檢測(cè)p16 蛋白的表達(dá)水平。當(dāng)前，

6、進(jìn)行p16蛋白IHC測(cè)定所用的抗p16抗體均為兔抗p16多克隆抗體(PoAbs)。國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室多用進(jìn)口PoAbs試劑盒，價(jià)格昂貴，性質(zhì)亦不穩(wěn)定。尚未見(jiàn)使用單克隆抗體 (McAbs)的報(bào)道。本研究以p16合成肽為抗原制備了鼠抗p16McAbs，應(yīng)用于IHC檢測(cè)，與進(jìn)口PoAbs進(jìn)行了比較。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 p16合成肽與試劑p16C末端第132148位17個(gè)氨基酸由美國(guó)QCB.Inc合成。氨基酸序 列為：H2NCSNHARIDAAEGPSDIPDCOOH。其中，胱氨酸(C)是一為偶聯(lián)特別構(gòu)成的氨基酸。 所用免疫化學(xué)試劑及胎牛血清等分別為美國(guó)Sigma、Gibco、Vector及

7、瑞典Pharmacia等產(chǎn)品 ，兔抗p16PoAbs(CatSC468、SC759)為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品。1.1.2 細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人胃癌細(xì)胞系MGC803及小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0分別由本所細(xì)胞室及 免疫室惠贈(zèng)，BALB/C小鼠及昆明小鼠由本所動(dòng)物室提供，p16陰性細(xì)胞株及人骨肉瘤細(xì)胞US2 OS來(lái)源于美國(guó)ATCC。1.1.3 病例與標(biāo)本闌尾組織以及乳腺癌、結(jié)直腸癌、食管癌及其斷端正常組織共30例石蠟 切片標(biāo)本，均經(jīng)本所病理科診斷證實(shí)并提供。1.2 方法1.2.1 抗原的制備將p16合成肽與載體蛋白KLH偶聯(lián)，方法參見(jiàn)文獻(xiàn)2。 1.2.2 免疫、細(xì)胞融合及克隆化免疫及細(xì)胞融合均

8、按常規(guī)方法進(jìn)行。經(jīng)HAT選擇性培養(yǎng)， 取細(xì)胞克隆生長(zhǎng)孔上清，進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)以及對(duì)正常闌尾組織IHC檢測(cè)，篩選 出雙陽(yáng)性孔，以有限稀釋法進(jìn)行克隆，經(jīng)3至4次克隆，選擇出單克隆分泌抗p16合成肽抗體 的雜交瘤細(xì)胞株。1.2.3 染色體計(jì)數(shù)按常規(guī)方法進(jìn)行。1.2.4 ELISA以p16合成肽、或KLH、或BSA包被96孔板，余按常規(guī)方法進(jìn)行。1.2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)及IHC法(ABC試劑測(cè)定) ?按常規(guī)方法進(jìn)行，結(jié)果判斷以細(xì)胞核及胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。1.2.6 制備富含McAbs的小鼠腹水及McAbs的純化按常規(guī)方法制備腹水。以50飽和硫酸銨 沉淀(鹽析法)及Protei

9、nASepharose CL4B柱(親和層析法)對(duì)腹水進(jìn)行純化，然后，經(jīng)PBS 透析濃縮，測(cè)定抗體濃度及活性，分裝，20保存。1.2.7 McAb亞類(lèi)鑒定將濃縮的無(wú)血清雜交瘤培養(yǎng)上清與兔抗鼠亞類(lèi)抗體進(jìn)行瓊脂糖雙向免 疫擴(kuò)散。1.2.8 McAb的純度及活性鑒定以10SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純度，以間接ELISA鑒 定活性。1.2.9 McAbs疊加試驗(yàn)及McAbs識(shí)別抗原表位分析首先，以p16合成肽1g/ml、50l/孔包 被96孔板，取McAbs，按系列倍比稀釋濃度加入各孔，進(jìn)行間接ELISA，測(cè)定OD492nm值，繪 制抗原飽和曲線，確定反應(yīng)達(dá)飽和點(diǎn)時(shí)各McAbs的濃度。其次，在p16

10、合成肽1g/ml、50l 孔包被的96孔板上，以達(dá)飽和點(diǎn)時(shí)抗體濃度，將兩種抗體各50l同時(shí)加入一孔，進(jìn)行間接E LISA，測(cè)得OD值，計(jì)算疊加指數(shù)(AI)3，若AI50，表明針對(duì)不同抗原表位。1.2.10 McAbs相對(duì)親和力的測(cè)定方法參見(jiàn)文獻(xiàn)4。1.2.11 免疫印跡(Western Blot)提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)15SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 ，進(jìn)行電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，將膜以3BSA封閉后，進(jìn)行間接免疫酶染色，DAB顯色。2 結(jié)果2.1 雜交瘤細(xì)胞株的建立經(jīng)細(xì)胞融合及選擇性培養(yǎng)，選取培養(yǎng)上清與p16合成肽及正常闌尾組織呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)、與 KLH及BSA無(wú)反應(yīng)的細(xì)胞，進(jìn)行4次克隆后，獲得4株分

11、泌抗p16合成肽抗體的單克隆細(xì)胞株， 分別命名為2B12、3B12、4B12及9F2。4株雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目在86108之間。反復(fù)凍融 雜交瘤細(xì)胞，仍保持穩(wěn)定分泌抗體。2.2 McAbs純度及活性純化后的McAbs經(jīng)10SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示，只有免疫球蛋白的輕、重鏈，表示純化滿意。經(jīng)ELISA檢測(cè)顯示，抗p16McAbs培養(yǎng)上清效價(jià)高于103，腹水效價(jià)高于107，純化后腹水1000g/ml，倍比稀釋檢測(cè)，效價(jià)高于105。2.3 McAbs的生物學(xué)性質(zhì)鑒定2.3.14株McAbs的亞類(lèi)均為IgG2型。2.3.2McAbs所識(shí)別的抗原表位檢測(cè)4種McAbs兩兩疊加，共有6種組合，任何兩種

12、抗體AI值 均小于50，表明具有競(jìng)爭(zhēng)抑制效應(yīng)，顯示4種McAbs識(shí)別p16合成肽抗原的同一表位。2.3.34種McAbs親和力相差不明顯，依次為9F2>3B12>2B12>4B12。2.3.4McAbs的特異性1)ELISA測(cè)定顯示，抗p16McAbs與p16合成肽抗原呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，而與KLH、BSA無(wú)交叉反應(yīng)。2)免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，抗p16McAbs與MGC803具有陽(yáng)性反應(yīng)，而 與p16陰性細(xì)胞株及US20S無(wú)反應(yīng)。3)WesternBlot結(jié)果顯示，純化的McAbs與MGC803提取總蛋 白電轉(zhuǎn)移后的硝酸纖微膜反應(yīng)，在分子量為16000處清晰地呈現(xiàn)一條著染線(1)。

13、1.低分子量標(biāo)準(zhǔn)2.與p16McAb(1:500)反應(yīng)3.與p16McAb(1:300)反應(yīng)4.與陰性對(duì)照正常鼠血清1McAb對(duì)應(yīng)抗原的免疫印跡分析2.3.5與進(jìn)口抗p16PoAbs的比較以自制McAbs與兩種進(jìn)口PoAbs分別對(duì)正常闌尾、乳腺癌、 結(jié)直腸癌、食管癌及斷端正常組織石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色，鏡下顯示，在斷端正常組織 、癌旁組織、部分或全部腫瘤組織細(xì)胞的胞核及胞漿內(nèi)均可見(jiàn)棕色顆粒，淋巴細(xì)胞無(wú)著染， 陽(yáng)性及陰性結(jié)果完全相符。但是，自制McAbs對(duì)于無(wú)論作過(guò)抗原修復(fù)或未經(jīng)抗原修復(fù)的組織切片染色無(wú)差別，而進(jìn)口多抗(SC486及SC759)對(duì)未經(jīng)抗原修 復(fù)的切片陽(yáng)性染色不明顯，只對(duì)進(jìn)行抗原

14、修復(fù)的切片著色力強(qiáng)(26)。抗p16McAb(9F2)為一抗。未經(jīng)抗原修復(fù)，胞漿、胞核內(nèi)可見(jiàn)棕色陽(yáng)性反應(yīng)顆粒。淋巴細(xì)胞染色呈陰性反應(yīng)2正常闌尾組織IHC染色×400抗p16McAb(9F2)為一抗。經(jīng)抗原修復(fù)3正常闌尾組織IHC染色×400抗p16PoAb(SC468)為一抗。經(jīng)抗原修復(fù)4正常闌尾IHC染色×400抗p16PoAb(SC759)為一抗。未經(jīng)抗原修復(fù)5正常闌尾組織IHC染色×400抗p16PoAb(SC759)為一抗。經(jīng)抗原修復(fù)6正常闌尾組織IHC染色×4003討論本研究以p16合成肽作為抗原，成功地建立了穩(wěn)定分泌抗p16 McA

15、bs的雜交瘤細(xì)胞系，并對(duì) McAbs的一般性質(zhì)作了系統(tǒng)分析，特別是，以表達(dá)p16的人胃癌細(xì)胞系MGC803為抗原進(jìn)行免疫 印跡鑒定，證明McAbs確實(shí)針對(duì)細(xì)胞內(nèi)p16蛋白，p16合成肽確實(shí)與細(xì)胞內(nèi)存在的p16抗原組成 成分相符。從而，肯定了此McAbs具備在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)p16表達(dá)的應(yīng)用價(jià)值。對(duì)于原發(fā)腫瘤細(xì)胞中p16檢測(cè)，最初多采用分子生物學(xué)方法，如PCR相關(guān)技術(shù)、Southern B lot、Northern Blot、Western Blot等，但由于腫瘤組織不可避免存在正常細(xì)胞，得到準(zhǔn)確結(jié) 果較為困難。以上方法又不適合檢測(cè)非遺傳變異，并且，實(shí)驗(yàn)技術(shù)繁瑣復(fù)雜。IHC不僅可避 免上述缺陷，還可檢

16、測(cè)微小病灶內(nèi)的p16表達(dá)，所需標(biāo)本量小，簡(jiǎn)便易行，日益受到研究者 們的重視。目前，用于IHC法進(jìn)行p16檢測(cè)的試劑多為國(guó)外生產(chǎn)的兔抗p16 Po Abs。本室制備的 鼠抗p16 McAbs與其比較，IHC檢測(cè)染色結(jié)果一致，陽(yáng)性及陰性符合率為100，并且，使用自 制McAbs時(shí)，組織切片無(wú)需進(jìn)行抗原修復(fù)，而進(jìn)口PoAbs需進(jìn)行抗原修復(fù)。這可能是由于此Mc Abs識(shí)別p16蛋白C末端17個(gè)氨基酸此部位抗原在石蠟切片制作過(guò)程中不易受到遮蔽的關(guān)系 。因此，簡(jiǎn)化了操作步驟、更具實(shí)用性。此外，進(jìn)口PoAbs價(jià)格昂貴、效價(jià)也不夠穩(wěn)定?？傊筽16 McAbs的獲得彌補(bǔ)了國(guó)內(nèi)p16檢測(cè)試劑的空白，為進(jìn)一步研

17、制p16臨床檢測(cè)試 劑盒奠定了良好的基礎(chǔ)，并為p16表達(dá)的研究創(chuàng)造了條件。(范錫鳳 校對(duì))本文課題受北京市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研基金資助 作者單位：萬(wàn)文徽北京醫(yī)科大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院北京腫瘤醫(yī)院(北京市100036)王青北京醫(yī)科大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院北京腫瘤醫(yī)院(北京市100036)李振甫北京醫(yī)科大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院北京腫瘤醫(yī)院(北京市100036)高學(xué)碩北京醫(yī)科大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院北京腫瘤醫(yī)院(北京市100036)鄂征北京醫(yī)科大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院北京腫瘤醫(yī)院(北京市100036)蔡紅北京醫(yī)科大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院北京腫瘤醫(yī)院(北京市100036)參考文獻(xiàn)1Tam SW,Shay J W,Pagano M,et al. Di

18、fferential expression and cell cycle regulation of cyclin dependent kinase 4 inhititor p16Ink4. Cancer Res,1994;54:58162Sambrook J,Fritsch E F ,Maniatis T. Molecular Cloning,Second edition,Cold Spring Harb or Laboratory Press,1989;18:83Friguet B,Djavadi Ohaniance L,Pages L,et al. A convenient enzymlinked immunosortent assay for testing whether monoclonal antitodies recognize the same ant