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文檔簡介
1、小鼠骨髓微核試驗(yàn)小鼠骨髓微核試驗(yàn)In vivo Mouse Bone Marrow Cytogenetics Test:Micronucleus Assay中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系預(yù)防醫(yī)學(xué)系肖勇梅肖勇梅(一)目的(一)目的學(xué)習(xí)和掌握小鼠骨髓多染紅細(xì)胞(學(xué)習(xí)和掌握小鼠骨髓多染紅細(xì)胞(PCE)微)微核測定方法。核測定方法。(二)原理(二)原理微核(微核(micronucleus)大小相當(dāng)于細(xì)胞直徑大小相當(dāng)于細(xì)胞直徑1/201/5,呈圓形或杏,呈圓形或杏仁狀,其染色與細(xì)胞核一致,在間期細(xì)胞中仁狀,其染色與細(xì)胞核一致,在間期細(xì)胞中可以出現(xiàn)一個或多個。可以出現(xiàn)一個或多個。(二)
2、原理(二)原理微核實(shí)驗(yàn)可檢測化學(xué)毒物或物理因素誘導(dǎo)產(chǎn)微核實(shí)驗(yàn)可檢測化學(xué)毒物或物理因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的生的染色體完整性改變?nèi)旧w完整性改變和和染色體分離改變?nèi)旧w分離改變兩兩種遺傳學(xué)終點(diǎn)。種遺傳學(xué)終點(diǎn)。凡能使染色體發(fā)生斷裂或使染色體和紡錘體凡能使染色體發(fā)生斷裂或使染色體和紡錘體聯(lián)結(jié)損傷的化學(xué)物,都可用微核試驗(yàn)來檢測。聯(lián)結(jié)損傷的化學(xué)物,都可用微核試驗(yàn)來檢測。(二)原理(二)原理有核細(xì)胞的胞質(zhì)少,微核與正常核葉及核的突起難以有核細(xì)胞的胞質(zhì)少,微核與正常核葉及核的突起難以鑒別。鑒別。嗜多染紅細(xì)胞的主核已排出,胞質(zhì)內(nèi)含有核糖體,姬嗜多染紅細(xì)胞的主核已排出,胞質(zhì)內(nèi)含有核糖體,姬姆薩染色呈灰藍(lán)色;成熟紅細(xì)胞(姆薩
3、染色呈灰藍(lán)色;成熟紅細(xì)胞(NCE)的核糖體已)的核糖體已消失,被染成淡桔紅色。骨髓中嗜多染紅細(xì)胞數(shù)量充消失,被染成淡桔紅色。骨髓中嗜多染紅細(xì)胞數(shù)量充足,微核容易辨認(rèn),而且微核自發(fā)率低,因此,骨髓足,微核容易辨認(rèn),而且微核自發(fā)率低,因此,骨髓中嗜多染紅細(xì)胞成為微核試驗(yàn)的中嗜多染紅細(xì)胞成為微核試驗(yàn)的首選細(xì)胞群首選細(xì)胞群。(三)器材與試劑(三)器材與試劑器材:器材: 手術(shù)刀、手術(shù)剪、無齒鑷、小型彎止手術(shù)刀、手術(shù)剪、無齒鑷、小型彎止血鉗、干凈紗布、帶橡皮頭吸管、晾片架、血鉗、干凈紗布、帶橡皮頭吸管、晾片架、玻璃蠟筆、玻璃染色缸、載玻片及推片、定玻璃蠟筆、玻璃染色缸、載玻片及推片、定時鐘、帶油鏡頭顯微鏡
4、、細(xì)胞計(jì)數(shù)器時鐘、帶油鏡頭顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)器試劑:甲醇(分析純)、甘油(分析純)、試劑:甲醇(分析純)、甘油(分析純)、小牛血清、生理鹽水、小牛血清、生理鹽水、Giemsa貯備液、磷酸貯備液、磷酸鹽緩沖液(鹽緩沖液(pH6.8)陽性對照物:環(huán)磷酰胺或絲裂霉素陽性對照物:環(huán)磷酰胺或絲裂霉素C(四)操作步驟(四)操作步驟1.實(shí)驗(yàn)動物與處理實(shí)驗(yàn)動物與處理動物選擇:常用大、小鼠動物選擇:常用大、小鼠染毒途徑:經(jīng)口、經(jīng)皮、經(jīng)呼吸道、注射染毒途徑:經(jīng)口、經(jīng)皮、經(jīng)呼吸道、注射染毒次數(shù)及取樣時間:染毒次數(shù)及取樣時間:劑量選擇:劑量選擇:35個或更多劑量組個或更多劑量組2.骨髓微核觀察的步驟骨髓微核觀察的步驟骨
5、髓制取骨髓制取涂片涂片固定固定染色染色觀察與計(jì)數(shù)觀察與計(jì)數(shù)正染紅細(xì)胞正染紅細(xì)胞 嗜多染紅細(xì)胞及微核嗜多染紅細(xì)胞及微核正染紅細(xì)胞正染紅細(xì)胞嗜多染紅細(xì)胞及微核嗜多染紅細(xì)胞及微核染色太淺染色太淺(五)結(jié)果分析與評價(五)結(jié)果分析與評價 微核率指含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù),以千微核率指含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù),以千分率(分率()表示)表示 若一個嗜多染紅細(xì)胞中出現(xiàn)兩個或兩個以上若一個嗜多染紅細(xì)胞中出現(xiàn)兩個或兩個以上微核,仍按一個有微核細(xì)胞計(jì)數(shù)微核,仍按一個有微核細(xì)胞計(jì)數(shù)(五)結(jié)果分析與評價(五)結(jié)果分析與評價正常的正常的PCE/NCE比值約為比值約為1(正常范圍(正常范圍0.61.2););PCE/NC
6、E0.1,陰性對照組和陽性對照組的微核發(fā)生率陰性對照組和陽性對照組的微核發(fā)生率多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法(多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法(Poinsson分布、二項(xiàng)分布、分布、二項(xiàng)分布、X2檢驗(yàn)等)均有人應(yīng)用檢驗(yàn)等)均有人應(yīng)用(五)結(jié)果分析與評價(五)結(jié)果分析與評價注意:本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟是制作注意:本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟是制作良好的骨髓涂片及優(yōu)質(zhì)的染色。良好的骨髓涂片及優(yōu)質(zhì)的染色。 (六)試驗(yàn)報(bào)告(六)試驗(yàn)報(bào)告 受試物名稱、理化性狀、配制方法、所用溶劑受試物名稱、理化性狀、配制方法、所用溶劑動物種屬和品系、體重、數(shù)量、性別、來源(注明合格證號和動動物種屬和品系、體重、數(shù)量、性別、來源(注明合格證號和動物級別)物級別)實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)環(huán)境,包括飼料來源、室溫、相對濕度、實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)環(huán)境,包括飼料來源、室溫、相對濕度、實(shí)驗(yàn)動物室合格證號室合格證號劑量分組,染毒途徑和方式劑量分組,染毒途徑和方式試驗(yàn)方法:簡述操作步驟,所用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法:簡述操作步驟,所用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果:以列表方式報(bào)告受試物對動物骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率(表結(jié)果:以列表方式報(bào)告受試物對動物骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率(表1)結(jié)論結(jié)論組別組別動物數(shù)動物數(shù)受檢細(xì)胞數(shù)受檢細(xì)胞數(shù)含微核細(xì)含微核細(xì)胞數(shù)胞數(shù)微核率微核率P值值(只
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