運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠骨胳肌細(xì)胞葡萄糖運(yùn)載體4的影響

1、    運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠骨胳肌細(xì)胞葡萄糖運(yùn)載體4的影響楊曉冰吳毅李益明李云霞占飛胡永善朱尚權(quán)張新堂平蓓芳 研究表明葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是骨胳肌細(xì)胞利用葡萄糖的主要限速步驟。在哺乳動(dòng)物中，這一過(guò)程是由細(xì)胞膜上的葡萄糖運(yùn)載體(glucose transporter, GLUT)參與并通過(guò)易化擴(kuò)散來(lái)完成的1。在目前已知的6種GLUT中，骨胳肌細(xì)胞中主要存在兩種，即GLUT1和GLUT4，前者活性低，只在基礎(chǔ)狀態(tài)下起作用；后者活性高，是骨胳肌細(xì)胞的主要葡萄糖運(yùn)載體。通過(guò)運(yùn)動(dòng)可提高骨胳肌細(xì)胞GLUT4蛋白含量，促進(jìn)肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)。但運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠糖代謝的

2、作用機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用鏈脲佐菌素(STZ)引起的糖尿病大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，觀察糖尿病大鼠骨胳肌細(xì)胞GLUT4蛋白含量的變化，以及運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)糖尿病大鼠骨胳肌細(xì)胞GLUT4蛋白含量的影響，探討運(yùn)動(dòng)改善糖尿病糖代謝紊亂的可能機(jī)制。 一、材料和方法 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性Sprague-Dawley大鼠(體重180220g)，購(gòu)自上海醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部。隨機(jī)分成三組，分別為糖尿病組、糖尿病運(yùn)動(dòng)組和正常對(duì)照組，每組6只。糖尿病動(dòng)物模型制備：大鼠腹腔內(nèi)注射STZ(溶于0.1mol/L檸檬酸緩沖液，pH 4.2)55mg/kg。第四日開(kāi)始測(cè)尿糖和血糖，尿糖在，且血糖在16.7mmol/L以上者確定為糖尿病大鼠

3、。糖尿病大鼠隨機(jī)分為兩組，一組為糖尿病組，另一組則為糖尿病運(yùn)動(dòng)組。糖尿病運(yùn)動(dòng)組按Ploug方法2進(jìn)行游泳訓(xùn)練，每周游泳5天，共6周，前兩周每天游泳40分鐘，以后每天游泳60分鐘。 附表實(shí)驗(yàn)前后大鼠血糖和血清胰島素的變化(±s) 數(shù)量 體重變化 血糖(mmol/L) 血清胰島素(mU/L) (g/d) 開(kāi)始 結(jié)束 開(kāi)始 結(jié)束 正常對(duì)照組 6 2.97±0.49 4.02±0.48 3.95±0.36 9.26±0.73 9.72±0.57 糖尿病組 6 1.40±0.28 19.88±2.03* 20.03±

4、;2.04* 3.91±0.25* 3.81±0.28* 糖尿病運(yùn)動(dòng)組 6 1.81±0.66 18.46±1.93* 14.0±3.25*# 4.03±0.26* 4.02±0.27* 注：與正常對(duì)照組比較，*P0.01；與運(yùn)動(dòng)前比較，#P0.01；與糖尿病比較，P0.01 最后一次游泳結(jié)束48小時(shí)后，尾靜脈采血，麻醉處死。第三組為正常對(duì)照組，大鼠腹腔內(nèi)注射等量的檸檬酸緩沖液。 2.大鼠骨胳肌細(xì)胞GLUT4蛋白含量的測(cè)定：(1)多克隆抗體的制備：按James方法3制備GLUT4蛋白羧基端12肽的多克隆抗體。具體過(guò)程如下：用

5、Merrifield固相合成法制備GLUT4蛋白羧基端12肽，以滅活的傷寒桿菌菌殼為載體，制成免疫原，免疫兔子。每3周加強(qiáng)一次。ELISA法測(cè)血清抗體滴度，獲滿(mǎn)意結(jié)果后，取血清，經(jīng)親和層析純化，透析，冷凍干燥，得到GLUT4蛋白羧基端12肽多克隆抗體干粉。(2)骨胳肌細(xì)胞膜的制備：用改良Klips方法4制備大鼠骨胳肌細(xì)胞膜。大鼠腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉(50mg/kg體重)麻醉，解剖后肢股四頭肌，肌肉約為10g，浸入0緩沖液A(250mmol/L Sucrose, 50mmol/L Tris, 0.2mmol/L EDTA, pH7.4)中，剪碎，勻漿，勻漿液以9000g離心10分鐘(4)，保

6、留上清，沉淀加入緩沖液A如上重復(fù)勻漿和離心，共3次，上清以190000g超速離心60分鐘(4)，取沉淀，加入少量緩沖液A后用玻璃勻漿器勻漿至均一，得骨胳肌細(xì)胞膜懸濁液，分裝后置于-70保存待用。膜蛋白濃度用Lowery改良法測(cè)定5。(3)Western blot法檢測(cè)骨胳肌細(xì)胞GLUT4蛋白含量：取3組大鼠骨胳肌細(xì)胞膜50g，在10%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行SDS凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上，NC膜浸于含5%脫脂奶粉的PBS中，在水浴搖床中溫育60分鐘(37)，然后加入多克隆抗體過(guò)夜(4)。洗滌后與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG水浴搖床溫育1小時(shí)(37)，充分洗滌后與ECL(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑

7、，購(gòu)自英國(guó)Amersham公司)反應(yīng)1分鐘，即刻用Kodak底片爆光，洗片后進(jìn)行掃描(島津雙波長(zhǎng)薄層掃描儀)，定量。以正常對(duì)照組的GLUT4蛋白含量為100作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算其他兩組的相對(duì)含量。 3.生化指標(biāo)的檢測(cè)：三組大鼠每?jī)商毂O(jiān)測(cè)尿糖，實(shí)驗(yàn)前后測(cè)尾靜脈全血糖和血清胰島素，血糖濃度用快速血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司產(chǎn)品,One Touch II型)檢測(cè)，血清胰島素濃度用放免法(中國(guó)華西糖尿病科技開(kāi)發(fā)研究所試劑盒)測(cè)定。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以x±s表示，組間差異采用t檢驗(yàn)。 二、結(jié)果 1.實(shí)驗(yàn)前后大鼠血糖和血清胰島素含量比較：糖尿病組與糖尿病運(yùn)動(dòng)組的血糖和血清胰島素的比較無(wú)顯著性差異，但與正常

8、對(duì)照組比較，2組的血糖顯著升高(t值分別為5.74和6.65，P0.01)，而血清胰島素降低(t值分別為7.59和5.90，P0.01)。經(jīng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，糖尿病運(yùn)動(dòng)組血糖較運(yùn)動(dòng)前降低24%(t=4.64，P0.01)，血清胰島素?zé)o顯著變化，而糖尿病組和正常對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前后血糖和血清胰島素均無(wú)改變。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，糖尿病運(yùn)動(dòng)組血糖較糖尿病組低30%(t=5.08,P0.01)，見(jiàn)附表。 2.3組大鼠骨胳肌細(xì)胞GLUT4蛋白含量的比較：結(jié)果顯示糖尿病大鼠骨胳肌細(xì)胞GLUT4蛋白的含量比正常對(duì)照組下降30.7%，糖尿病運(yùn)動(dòng)組大鼠骨胳肌GLUT4蛋白的含量比糖尿病組升高60.8%。 三、討論 本實(shí)驗(yàn)利用較小劑

9、量STZ(55mg/kg)來(lái)制備糖尿病大鼠動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，STZ糖尿病大鼠血糖顯著升高，血清胰島素下降，骨胳肌細(xì)胞的GLUT4蛋白含量較正常對(duì)照組下降30.7%。Ramlal等6的研究顯示STZ大鼠骨胳肌細(xì)胞GLUT4蛋白含量較正常下降37%，這可能是由于本實(shí)驗(yàn)采用的STZ的劑量比Ramlal采用的劑量(65mg/kg)更小的緣故。Napoli等7同樣利用STZ糖尿病動(dòng)物模型證實(shí)，糖尿病大鼠葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能的障礙與GLUT4蛋白內(nèi)在活性的降低、GLUT4蛋白含量及轉(zhuǎn)位機(jī)制障礙等因素有關(guān)。 Marette等8進(jìn)一步對(duì)SHR/N-CP肥胖型糖尿病大鼠的研究表明，這類(lèi)大鼠早期出現(xiàn)高血糖高胰島素血

10、癥，骨胳肌細(xì)胞的GLUT4蛋白的含量較正常對(duì)照組大鼠減少40%，認(rèn)為高血糖的毒性作用可能與之有關(guān)，而且慢性高胰島素可能與高血糖起協(xié)同作用，導(dǎo)致骨胳肌細(xì)胞GLUT4蛋白含量的減少，同時(shí)實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞內(nèi)GLUT4 mRNA含量減少87%，說(shuō)明由于GLUT4基因轉(zhuǎn)錄能力下降，使GLUT4蛋白合成減少，導(dǎo)致肌細(xì)胞攝取和利用葡萄糖的能力下降。本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物模型表現(xiàn)為高血糖和低胰島素血癥，同樣發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠骨胳肌細(xì)胞GLUT4蛋白含量明顯減少。Youn等9采用了鉗夾技術(shù)以維持STZ大鼠血中高胰島素和正常血糖濃度，研究STZ大鼠GLUT4蛋白水平隨時(shí)間變化的過(guò)程，雖然血糖維持在正常水平，但骨胳肌GLUT4蛋白水

11、平仍下降，糖尿病大鼠骨胳肌細(xì)胞GLUT4蛋白含量均減少，從而對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取減少，出現(xiàn)胰島素抵抗現(xiàn)象。GLUT4蛋白含量的減少可能與GLUT4基因轉(zhuǎn)錄功能的下降有關(guān)。 運(yùn)動(dòng)可改善外周組織對(duì)葡萄糖的攝取和利用，不同方式的運(yùn)動(dòng)后，正常大鼠骨胳肌GLUT4蛋白含量上升30%200%不等10-11。去神經(jīng)骨胳肌收縮研究進(jìn)一步證實(shí)，收縮運(yùn)動(dòng)是骨胳肌GLUT4基因表達(dá)的一種調(diào)節(jié)因素12。Friedman等10在對(duì)肥胖大鼠進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可刺激骨胳肌細(xì)胞GLUT4蛋白含量的增加，從而提高骨胳肌細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性。本實(shí)驗(yàn)中STZ糖尿病大鼠經(jīng)過(guò)6周的游泳運(yùn)動(dòng)后，血糖水平明顯低于運(yùn)動(dòng)前水平，

12、同時(shí)與糖尿病組大鼠相比，血糖水平明顯降低，而血清胰島素水平無(wú)明顯變化，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)后盡管糖尿病大鼠的血清胰島素仍處于較低的水平，但機(jī)體外周組織(主要是骨胳肌細(xì)胞)對(duì)葡萄糖的攝取和利用卻明顯增加，致血糖較運(yùn)動(dòng)前降低。通過(guò)對(duì)3組大鼠骨胳肌細(xì)胞GLUT4蛋白含量的測(cè)定表明，糖尿病運(yùn)動(dòng)組大鼠骨胳肌細(xì)胞GLUT4蛋白含量明顯高于糖尿病組大鼠，GLUT4蛋白含量的增加可能與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練促進(jìn)糖尿病大鼠骨胳肌細(xì)胞GLUT4基因表達(dá)的增加有關(guān)。提示運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以提高糖尿病大鼠骨胳肌GLUT4蛋白的含量，GLUT4蛋白含量的增加可能是外周組織攝取和利用葡萄糖增加的主要原因之一。另外運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練改善了糖尿病機(jī)體外周組織對(duì)胰島素的

13、敏感性，促進(jìn)機(jī)體對(duì)葡萄糖利用，從而使血糖明顯下降。 本課題為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 3940012 作者單位：200040 上海華山醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科(楊曉冰、吳毅、李云霞、占飛、胡永善)，糖尿病研究室(李益明)；中科院上海生化所(朱尚權(quán)、張新堂、平蓓芳) 參考文獻(xiàn) 1Fink P, Wallace P, Brechtel G, et al. Evidence that glucose transport is rate limiting for in vivo glucose uptake. Metabolism, 1992,41:897-902. 2Ploug T, Stallknecht

14、BN, Pedersen D, et al. Effect of endurance training on glucose transport capacity and glucose tranporter expression in rat skeletal muscle. Am J Physiol, 1990,259:E778-E786. 3James D, Strube M, Mueckler M, et al. Molecular cloning and characterization of an insulin-regulatable glucose transporter. N

15、ature, 1989,338:83_87. 4Klip A, Ramlal T, Young AJ, et al. Insulin-induced translocation of glucose transporters in rat hindlimb muscles. FEBS Lett, 1987,244:224_230. 5Lowery OH, Rosebrough HJ, Farr AL, et al. Protein measurement with the folinphenol reagent. J Biol Chem, 1951,193:265_275. 6Ramlal T

16、, Rastogi S, Vranic M, et al. Decrease in glucose transporter number in skeletal muscle of mildly diabetic (streptozotocin-treated) rats. Endocrinology, 1989,125(2):890_897. 7Napoli R, Hirshman MF, Horton ES. Mechanisms and time course of impaired skeletal muscle glucose transport activity in strept

17、ozocin diabetic rats. J Clin invest, 1995,96:427_437. 8Marette A, Atgie C, Liu Z, et al. Differential regulation of GLUT1 and GLUT4 glucose transporters in skeletal muscle of a new model of type II diabetes. Diabetes, 1993,42:1195_1201. 9Youn JH, Kim JK, Buchanan TA. Time courses of changes in hepat

18、ic and skeletal muscle insulin action and GLUT4 protein in skeletal muscle after STZ injection. Diabetes, 1994,43:564_571. 10Friedman JE, Sherman WM, Reed MJ, et al. Exercise training increases glucose transporter protein GLUT4 in skeletal muscle of obese Zucker (fa/fa) rats. FEBS Lett, 1990,268:13_16. 11Rodnick KJ, Henriksen EJ, James DE, et al. Exercise trai