熒光定量RT-PCR法監(jiān)測(cè)肺癌患者化療前后外周血淋巴細(xì)胞mdr1 mRNA的變化

1、    熒光定量RT-PCR法監(jiān)測(cè)肺癌患者化療前后外周血淋巴細(xì)胞mdr1 mRNA的變化熒光定量RT-PCR法監(jiān)測(cè)肺癌患者化療前后外周血淋巴細(xì)胞mdr1 mRNA的變化王梅1,葛明建2(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院:1檢驗(yàn)科,2胸外科,重慶400016)提要:目的檢測(cè)肺癌患者化療前后外周血淋巴細(xì)胞(PBL)中多藥耐藥基因(mdr1)表達(dá)水平,探討其與化療療效的相互關(guān)系。方法分別于化療開(kāi)始前及化療周期結(jié)束后第3周收集肺癌患者(n=32)外周血標(biāo)本。采集標(biāo)本的同時(shí)行胸片或胸部CT掃描,并計(jì)算腫瘤最大徑及垂直徑的乘積。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)( fqR

2、T-PCR)法檢測(cè)PBL中mdr1基因的表達(dá)。結(jié)果與化療前相比,化療后PBL中mdr1 mRNA水平上升顯著(3·881 8±0·828 0)與(4·3166±0·923 1),t=-4. 207,P=0. 000?；熐昂笸庵苎猰dr1 mRNA水平變化與腫瘤大小改變間亦存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0·389,P=0·028)?；熐靶〖?xì)胞肺癌(SCLC)與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者PBL中mdr1轉(zhuǎn)錄本水平間存在顯著性差異, SCLC明顯低于NSCLC(2·831 4±0·398 4

3、)與(4·231 9±0·603 4),t=6. 101,P=0·000。結(jié)論NSCLC及SCLC在化療耐藥機(jī)制上可能存在差異性。檢測(cè)患者化療前后PBL中mdr1 mRNA水平對(duì)判定化療療效有一定的指導(dǎo)意義,可在一定程度上指導(dǎo)化療方案的修訂。關(guān)鍵詞:肺腫瘤;血液;聚合酶鏈反應(yīng);藥物耐受性;信使RNA;化學(xué)療法中圖法分類號(hào):R331. 144;R730. 43;R734. 2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:ALongitudinal study of mdr1 level in peripheral blood lymphocyte by fluorescent quanti

4、tative real time RT-PCR before and after chemotherapy WANGMei1,GE Ming-Jian2(1Department of Clinical Laboratory,2Department of Thoracic Surgery,The FirstAffiliated Hospital,ChongqingUniversity ofMedicalSciences,Chongqing 400016,China)Abstract:ObjectiveTo detectmultidrug resistance gene(mdr1)transcri

5、ption in peripheralblood lym-phocyte(PBL)before and after chemotherapy and to determine its correlation with chemotherapeutic effec.t MethodsThe peripheralblood samplewas taken from each lung cancerpatients(n=32)before chemothera-py and at3rdweek after chemotherapy and subjected to fluorescentquanti

6、tative real-timeRT-PCR. Simultane-ously the tumorsizewasdetermined by chestX-ray orCT.ResultsThemdr1mRNA level in PBL afterchem-otherapy increased significantly as comparedwith thatbefore chemotherapy(4. 316 6±0. 923 1)vs(3. 881 8 ±0. 828 0),t=-4. 207,P=0·000. Therewas an negative cor

7、relation betweenmdr1 mRNA level and the tumor size(r=-0. 389,P=0. 028). The level ofmdr1 transcription in SCLC patientswas significantly less than thatofNSCLC patients before chemotherapy(2. 831 4±0. 398 4)vs(4. 231 9±0. 603 4),t=6. 101,P=0. 000.ConclusionIn terms ofan anticancerdrug resis

8、tantmechanism,there could be a difference be-tweenNSCLC and SCLC. Longitudinal study ofmdr1 level in PBL is valuable for evaluating the treatment response.Keywords:lungneoplasm;blood;polymerase chain reaction;drug tolerance;messengerRNA;chemotherapy由于外科手術(shù)技術(shù)的完善以及腫瘤局部治療措施(如放療)療效的不斷提高,如今癌癥治療失敗的主要原因?yàn)檫h(yuǎn)處轉(zhuǎn)

9、移。這就要求我們努力尋找有效的全身性輔助治療手段。而在此之前,我們需要確定哪些患者能從這些輔助治療中獲益1。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察化療期間肺癌患者外周血淋巴細(xì)胞(peripheral blood lymphocyte, PBL)中mdr1表達(dá),并探討其與化療療效相互關(guān)系。1材料與方法1. 1臨床資料本組共32例患者,均為2003年1-6月重慶市肺部腫瘤綜合治療中心呼吸內(nèi)科的住院患者。所有患者都經(jīng)病理檢查證實(shí)診斷為肺癌。其中男性24例,女性8例,年齡3368歲,中位年齡52歲。按1997國(guó)際抗癌聯(lián)盟分期標(biāo)準(zhǔn),期6例,期10例,期16例。非小細(xì)胞肺癌24例(含肺鱗癌15例及肺腺癌9例),小細(xì)胞肺癌8例。經(jīng)

10、患者同意后,分別于化療開(kāi)始前及化療周期結(jié)束后第3周收集外周血標(biāo)本各5 ml。采集標(biāo)本的同時(shí)患者行胸片或胸部CT掃描,并根據(jù)檢查結(jié)果計(jì)算腫瘤最大徑及垂直徑的乘積(cm2)。對(duì)照組(n=20)外周血標(biāo)本來(lái)自健康體檢者。所有患者均為初診并接受第1周期化療。其中小細(xì)胞肺癌( SCLC)患者的化療方案為:鬼臼乙甙100 mg/m2,第13天;順鉑50 mg/m2,第1天。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的化療方案為:絲裂霉素10 mg/m2,第1天和第8天;長(zhǎng)春酰胺3 mg/m2,第1天;順鉑80 mg/m2,第1天?；煰熜?完全緩解2例,部分緩解13例,無(wú)效15例,病變惡化2例。分期方法包括胸片、支氣

11、管鏡、胸部CT、超聲檢查、骨掃描及活檢術(shù)(如轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)活檢等)。1. 2實(shí)驗(yàn)方法1. 2. 1提取RNA運(yùn)用人淋巴細(xì)胞分離液(上?；瘜W(xué)試劑二廠)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNs)。按TrizolReagent(In-vitrogen, Cat#15596-026)的說(shuō)明提取PBMNs中的總RNA。通過(guò)測(cè)定D(260)計(jì)算RNA的濃度,以D(260) /D(280)值判定純度, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。1. 2. 2合成cDNA總RNA在70中孵育5 min。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在18l1×RT緩沖液50 mmol/L Tris-HCl (pH 8. 3),75 mmol/L KCl及3

12、 mmol/L MgCl2中完成,同時(shí)加入0. 5 mmol/L dNTP, 1l RNasin及200 U MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega),合成條件為3730 min。1. 2. 3引物與探針運(yùn)用PrimerExpress軟件(PE Applied Biosystems)來(lái)設(shè)計(jì)合適的Taqman引物和探針。Taqman探針的5端被報(bào)告基團(tuán)FAM(發(fā)光波長(zhǎng)為518 nm)標(biāo)記,而3端被磷酸化以防止PCR過(guò)程中其自身序列的延伸。mdr1的引物序列為(53):上游引物AACGTCGAACACGGTCTCATC;下游引物ATAACAGCATACCGCGCTCAC。探針序列為(53): TT-GT

13、GAAGAAGGCTTGTGTCGATGCC。引物和探針均由上海生工生物工程有限公司合成。1. 2. 4Taqman PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)在以下反應(yīng)體系中完成: 43l PCR反應(yīng)緩沖液10 mmol/L Tris-HCl(pH 8. 4),50 mmol/L KCl及1. 5 mmol/LMgCl2, 0. 2 mmol/L dNTP, 5lCDNA, 2 UTaqDNA聚合酶(Promega),上、下游引物各0. 4mol/L,首先在95水平預(yù)變性5 min,然后按以下反應(yīng)條件完成35個(gè)循環(huán): 9530 s, 6220 s, 7220 s。最后在72下延伸10min結(jié)束反應(yīng)。在每一批PCR

14、反應(yīng)中設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照(提自LC-5細(xì)胞的RNA)及陰性對(duì)照(水)。所有反應(yīng)均在ABI Prism 7000序列檢測(cè)系統(tǒng)上完成。根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到各檢測(cè)標(biāo)本的起始濃度(基因拷貝數(shù)/ml)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以每毫升血清中mdr1 mRNA拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)表示。所有反應(yīng)均在ABI Prism 7000序列檢測(cè)系統(tǒng)(Perkin-ElmerApplied Biosystem)中完成。它主要原理是根據(jù)PCR過(guò)程中熒光標(biāo)記探針?biāo)l(fā)出的熒光信號(hào)來(lái)計(jì)算CK19mRNA的起始拷貝數(shù)。7000系統(tǒng)包含1個(gè)內(nèi)置的熱循環(huán)儀以通過(guò)纖維光纜與96個(gè)標(biāo)本孔均相連的激光檢測(cè)頭。CCD(charge-coupled devic

15、e)攝像頭可收集發(fā)自每個(gè)標(biāo)本的熒光信號(hào)并且進(jìn)行自動(dòng)分析。檢測(cè)系統(tǒng)自帶的軟件可以計(jì)算Ct(threshold cycle)值并確定每個(gè)標(biāo)本的起始拷貝數(shù)。1. 3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 10. 0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及兩變量相關(guān)性分析等。2結(jié)果2. 1熒光定量PCR相關(guān)曲線當(dāng)報(bào)告基團(tuán)的熒光強(qiáng)度超過(guò)閾值( threshold)時(shí)的循環(huán)數(shù)就是Ct值(cycle threshold)。以Ct值作為縱坐標(biāo),mdr1起始拷貝數(shù)作為橫坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1),此曲線顯示4個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍。熒光定量PCR的擴(kuò)增過(guò)程包括3個(gè)階段:基線期(baseline phase)、指數(shù)期(expo

16、nential phase)及平臺(tái)期(plat-eau phase)。圖2示一典型的實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線。2. 2化療前后PBL中mdr1 mRNA水平變化與化療前相比,化療后肺癌患者PBL中mdr1 mRNA水平上升顯著(3.881 8±0. 828 0與4. 316 6±0. 923 1,t=-4.207,P=0. 000)。mdr1 mRNA水平變化與腫瘤大小改變間亦存在負(fù)相關(guān)(r=-0. 389,P=0. 028)。圖1mdr1 mRNA起始濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線RT-PCR法監(jiān)測(cè)肺癌患者化療前后外周血淋巴細(xì)胞mdr1 mRNA的變化圖2實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線2. 3化療

17、期間SCLC與NSCLC患者PBL中mdr1mR-NA水平比較化療前SCLC與NSCLC患者PBL中mdr1轉(zhuǎn)錄本水平間存在顯著差異, SCLC明顯低于NSCLC(2·831 4±0. 398 4)與(4. 2319±0. 603 4),t=6. 101,P=0. 000。治療前后2組患者比較, mdr1 mRNA水平變化無(wú)顯著差別(t=1. 116,P=0·273)?；熎陂gmdr1 mRNA水平改變與腫瘤分期、患者性別及年齡等無(wú)關(guān)(P>0. 05)。3討論能定量檢測(cè)標(biāo)志物基因表達(dá)水平的精細(xì)變化代表了一個(gè)里程碑。與現(xiàn)有的其他定量PCR方法相比,實(shí)

18、時(shí)PCR法有一些明顯的優(yōu)點(diǎn)2。實(shí)時(shí)PCR的重要特征之一就是在PCR產(chǎn)物擴(kuò)增過(guò)程中實(shí)時(shí)得出產(chǎn)物的量,這一點(diǎn)與終點(diǎn)檢測(cè)法完全不同,后者是只有當(dāng)反應(yīng)完成預(yù)設(shè)循環(huán)數(shù)后才計(jì)算產(chǎn)物的累積數(shù)量。靶基因的起始拷貝數(shù)越高,則反應(yīng)過(guò)程中能被監(jiān)測(cè)到的增高的熒光信號(hào)就越早。Ct值就是指反應(yīng)過(guò)程中熒光探針被裂解產(chǎn)生的熒光信號(hào)超過(guò)預(yù)設(shè)的閾值高于基線水平時(shí)的循環(huán)數(shù)。Holland等3首先運(yùn)用Taqman技術(shù)對(duì)單管RT-PCR法進(jìn)行優(yōu)化后來(lái)定量檢測(cè)靶基因的量,其原理就是利用TaqDNA聚合酶的53核酸外切酶的活性。不久,這一方法就被改進(jìn),人們運(yùn)用雙標(biāo)記的熒光探針,而這種探針可以特異性地與引物間的模板序列結(jié)合。探針的5端被標(biāo)記

19、上熒光報(bào)告基團(tuán)FAM(6-羧基熒光素),而3端則被標(biāo)記上熒光淬滅基團(tuán)(6-羧基四甲基若丹明)。當(dāng)熒光探針結(jié)構(gòu)完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)的發(fā)射頻譜就被淬滅抑制,一旦與模板緊密結(jié)合的探針被核酸酶降解后,就會(huì)釋放出報(bào)告基團(tuán),導(dǎo)致熒光信號(hào)的增加。PCR過(guò)程中,熒光產(chǎn)生越多,提示產(chǎn)物的量就越多,兩者成正比。ABI Prism 7000檢測(cè)儀就能檢測(cè)到這種熒光信號(hào)。在一個(gè)具體的反應(yīng)中,若某一個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)水平開(kāi)始增加并高于背景水平時(shí),則該循環(huán)數(shù)就被稱為循環(huán)閾值(Ct value)。Ct值與標(biāo)本中的mRNA起始拷貝數(shù)成反比。在反應(yīng)的指數(shù)增長(zhǎng)期,可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào),這樣就允許對(duì)許多標(biāo)本進(jìn)行同時(shí)分析,而勿需考慮不同標(biāo)本

20、可能在不同循環(huán)時(shí)到達(dá)反應(yīng)平臺(tái)的因素的影響。通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線可完成對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確定量。若知道某個(gè)標(biāo)本的Ct值,就可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到該標(biāo)本中靶基因起始量。標(biāo)準(zhǔn)曲線是根據(jù)線性回歸分析法計(jì)算得來(lái)的,它顯示了Ct值與起始濃度對(duì)數(shù)間的線性關(guān)系(圖1)。本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)均以每毫升血清中mdr1 mRNA拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)來(lái)表示。理論上,本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法的靈敏度,即能夠有效檢測(cè)并定量的mdr1mRNA的最小量為1 000拷貝/ml。實(shí)際上,本實(shí)驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)到的最低濃度為4. 2×102拷貝/m,l原因是標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍允許我們檢測(cè)低于濃度動(dòng)態(tài)范圍下限值(1×103拷貝/ml)以下濃度的標(biāo)本。同理

21、,也可以測(cè)定濃度高于108拷貝/ml的待測(cè)標(biāo)本。因此,理想的濃度檢測(cè)范圍和靈敏度允許我們來(lái)測(cè)定起始濃度相差很大的外周血標(biāo)本。就方法的特異性而言,只有與探針結(jié)合的靶序列被擴(kuò)增的時(shí)候,Taqman熒光探針才會(huì)發(fā)生斷裂,從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。因此,非特異性擴(kuò)增時(shí)是不會(huì)有熒光信號(hào)產(chǎn)生的。另一方面,由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程缺少了PCR后的操作步驟(如瓊脂糖凝膠電泳),真正避免了前次PCR產(chǎn)物的后續(xù)污染可能帶來(lái)的假陽(yáng)性。多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)是由一種藥物誘發(fā)而同時(shí)對(duì)其他多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的抗癌藥物產(chǎn)生的交叉耐藥現(xiàn)象,即癌細(xì)胞對(duì)廣泛的結(jié)構(gòu)和功能不相同的抗腫瘤藥物產(chǎn)生的耐藥,從

22、而導(dǎo)致某些聯(lián)合化療方案失敗4。腫瘤耐藥原因很多,目前公認(rèn)最主要的是多藥耐藥基因的過(guò)度表達(dá),克服此障礙,腫瘤化療將取得決定性突破。迄今為止,文獻(xiàn)5報(bào)道的聯(lián)合化療的有效率大約為30%。mdr1基因編碼的蛋白產(chǎn)物為一ATP依賴的、專門針對(duì)廣譜異型生物質(zhì)復(fù)合物的藥物泵,由于該流出泵的作用,使得癌細(xì)胞內(nèi)的藥物聚集減少,從而產(chǎn)生抗癌藥物耐藥性。檢測(cè)患者化療前后PBL中mdr1 mRNA水平對(duì)判定療效及預(yù)后有一定的指導(dǎo)意義,可在一定程度上指導(dǎo)化療方案的修訂或選擇應(yīng)用耐藥逆轉(zhuǎn)劑。一般認(rèn)為,直接獲取腫瘤組織并檢測(cè)其mdr1基因表達(dá)1981能最直接、真實(shí)地反映mdr1 mRNA水平,但臨床上存在難以獲取或病灶消散

23、后無(wú)從獲取的問(wèn)題。相反,檢測(cè)PBL中的mdr1基因表達(dá)則簡(jiǎn)便易行,臨床上能反復(fù)定期獲取血液標(biāo)本,可長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)mdr1基因表達(dá)水平變化,且不易受雜質(zhì)細(xì)胞干擾,能較穩(wěn)定地獲取結(jié)果6。傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定實(shí)體瘤療效是通過(guò)觀察化療前后腫瘤大小改變來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果顯示,治療前后PBL中mdr1基因表達(dá)差異與腫瘤大小變化間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0. 389,P=0. 028),提示檢測(cè)患者化療前后PBL中mdr1基因表達(dá)水平對(duì)判定療效有幫助。此外,化療前SCLC與NSCLC患者PBL中mdr1mRNA水平存在顯著差異, SCLC明顯低于NSCLC(P<0·05),即在未進(jìn)行化療前, NSCL

24、C患者PBL中mdr1基因就已呈高表達(dá),表明NSCLC患者可能存在內(nèi)在性耐藥性,即先天耐藥。與此同時(shí), SCLC對(duì)化療的耐藥則可能是獲得性的。NSCLC及SCLC在化療耐藥機(jī)制上可能存在差異性。有研究表明,卵巢癌細(xì)胞不僅可以表達(dá)mdr1基因的蛋白產(chǎn)物P170,并且可隨化療療程的增加而耐藥逐漸增強(qiáng),PBL中P170的含量可間接反映殘余或復(fù)發(fā)卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物耐受的程度7。接受化療的患者中非緩解組化療后PBL的mdr1基因表達(dá)水平與化療前及對(duì)照組相比有顯著差異6。近年來(lái),有不少研究結(jié)果顯示mdr1基因或其編碼的糖蛋白產(chǎn)物(P-gp)在組織或細(xì)胞株中的過(guò)表達(dá)或陽(yáng)性表達(dá)與肺癌的化療敏感性間存在相關(guān)性

25、8-12。本研究對(duì)肺癌患者PBL中的mdr1基因表達(dá)水平與化療反應(yīng)間的關(guān)系進(jìn)行了初步探索,研究結(jié)果與以上基于腫瘤組織表達(dá)的研究結(jié)果一致。此外,本法的檢測(cè)對(duì)象為外周血,標(biāo)本容易獲得且可進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀測(cè),因此可對(duì)患者進(jìn)行長(zhǎng)期觀察,以便及時(shí)調(diào)整化療方案,具有更加明顯的優(yōu)勢(shì)。研究mdr1基因表達(dá)與臨床化療的關(guān)系,是從分子水平來(lái)探討腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性與耐受性,可用來(lái)預(yù)測(cè)患者對(duì)化療的反應(yīng)以及化療過(guò)程中療效的判斷和監(jiān)測(cè)預(yù)后,可在更高水平上對(duì)腫瘤進(jìn)行治療和觀察,使化療個(gè)體化、合理化。臨床醫(yī)師可根據(jù)化療過(guò)程中每個(gè)患者PBL中mdr1基因的表達(dá)水平變化來(lái)判斷耐藥程度,從而制定合理的化療方案。參考文獻(xiàn):1 GE M

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