項(xiàng)目實(shí)訓(xùn)手冊(cè)-項(xiàng)目9-葡萄干菌落總數(shù)快速檢驗(yàn)-3M試紙片

1、農(nóng)產(chǎn)品微生物檢驗(yàn)技術(shù)課程實(shí)訓(xùn)指導(dǎo)手冊(cè)項(xiàng)目九 葡萄干菌落總數(shù)快速檢驗(yàn)-3M試紙片（依據(jù) SN/T 0168-2015進(jìn)出口食品中菌落總數(shù)計(jì)數(shù)方法與3M試紙片操作說(shuō)明書）一、實(shí)訓(xùn)目的以3M試紙片進(jìn)行樣品中菌落總數(shù)計(jì)數(shù)，熟練使用各類3M試紙片進(jìn)行檢驗(yàn)操作，明確常用微生物快速檢驗(yàn)方法的原理與優(yōu)缺點(diǎn)與注意事項(xiàng)。二、實(shí)訓(xùn)原理PetrifilmTM是3M公司專利發(fā)明，將傳統(tǒng)的瓊脂平板或試管的培養(yǎng)方法濃縮在小小的一張測(cè)試片上，現(xiàn)階段共有十余種測(cè)試片，比較常用的有：菌落總數(shù)測(cè)試片、大腸菌群計(jì)數(shù)測(cè)試片 、快速大腸菌群計(jì)數(shù)測(cè)試片、高靈敏度大腸菌群計(jì)數(shù)測(cè)試片、大腸桿菌/大腸菌群計(jì)數(shù)測(cè)試片 、腸桿菌科測(cè)試片、霉菌和酵母

2、菌計(jì)數(shù)測(cè)試片、快速金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)測(cè)試片、環(huán)境李斯特菌測(cè)試片三、實(shí)訓(xùn)要求本項(xiàng)目3M試紙片進(jìn)行樣品中菌落總數(shù)計(jì)數(shù)快速檢驗(yàn)依據(jù)SN/T 0168-2015進(jìn)出口食品中菌落總數(shù)計(jì)數(shù)方法與3M試紙片說(shuō)明書進(jìn)行檢驗(yàn)操作，標(biāo)準(zhǔn)與操作說(shuō)明書規(guī)定了3M試紙片進(jìn)行樣品中菌落總數(shù)計(jì)數(shù)快速檢驗(yàn)的基本要求、操作程序和結(jié)果判定。本項(xiàng)目全面考察學(xué)生依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)與操作說(shuō)明進(jìn)行微生物快速檢驗(yàn)的能力。本項(xiàng)目實(shí)施過程可分為樣品準(zhǔn)備、接種、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)4個(gè)步驟。本項(xiàng)目按2人/組為單位進(jìn)行操作，要求在實(shí)驗(yàn)室完整使用3M試紙片進(jìn)行樣品中菌落總數(shù)計(jì)數(shù)快速檢驗(yàn)。四、實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備 1 試劑和溶液無(wú)菌生理鹽水、75%乙醇。2 儀器和設(shè)備除微生物

3、實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料包括冰箱、天平、剪刀、鑷子、移液管、錐形瓶、試管、恒溫培養(yǎng)箱、均質(zhì)器及耗材、達(dá)到精度要求的pH計(jì)，超凈工作臺(tái)或百級(jí)潔凈實(shí)驗(yàn)室。五、實(shí)訓(xùn)任務(wù)（包含結(jié)果計(jì)算）1、樣品制備以無(wú)菌操作取有代表性的樣品盛于滅菌容器內(nèi)。如有包裝，用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。a） 固體和半固體樣品：無(wú)菌操作，稱取25 g樣品置盛225 mL生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000 r/min10000 r/min均質(zhì)1 min2 min，或放入盛有 225 mL 稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min2 min，制成 1:10 的樣品勻液。如樣品均質(zhì)時(shí)間超過2 min，

4、應(yīng)在均質(zhì)杯外加冰水冷卻。b） 干粉：無(wú)菌操作，稱取25 g樣品，置盛225 mL生理鹽水和適量玻璃珠的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，迅速振搖，將樣品混勻，制成 1:10 的樣品勻液。振搖時(shí)，幅度為30 cm，7 s內(nèi)振搖25次，也可以極其振搖15 s。c） 液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25 mL樣品置盛有225 mL生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，制成 1:10 的樣品勻液。吸取樣品時(shí)，吸管插入液面下不要超過2.5 cm。吸管內(nèi)液體要在24 s內(nèi)完全排入稀釋劑。不要在稀釋劑中吹洗吸管。無(wú)菌制備樣品，制備10-1、10-2、10-3適宜的稀釋度，并均質(zhì)。在操作手冊(cè)中，首先介紹了3M

5、試紙片的合理存放，3M試紙片需要冷藏，并需注意保質(zhì)期，且需在開包前將包裝物恢復(fù)至室溫；對(duì)于已開封的包裝，繼續(xù)存放時(shí)則需用膠帶封禁封口；并不在冷藏，同時(shí)注意需要在1個(gè)月內(nèi)使用完。2、接種a） 選擇合適的連續(xù)3個(gè)稀釋度，揭開試紙片上層膜，接種1 mL樣液垂直滴加在試紙片中央處，做兩個(gè)平行重復(fù)，小心蓋上上層莫，注意不要有氣泡。b） 用包裝中適配的壓板凹面朝下，對(duì)準(zhǔn)后，輕壓30秒后，靜置試紙片至少1 min待培養(yǎng)基凝固。3、培養(yǎng)3M試紙片透明面朝上，堆疊不超過20片，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，36±1，培養(yǎng)48±2 h。4、計(jì)數(shù)到培養(yǎng)時(shí)間后立即計(jì)數(shù)，如果不能立即進(jìn)行計(jì)數(shù)，可以將試紙片放在-

6、15條件下，不超過7 d.計(jì)算結(jié)果只保留兩位有效數(shù)字，見表1表1對(duì)所有成對(duì)的平板都要計(jì)數(shù)，并將計(jì)數(shù)的結(jié)果按規(guī)定的計(jì)算后報(bào)告。25250 CFU為正常計(jì)數(shù)范圍。不足25 CFU或者超過250 CFU計(jì)數(shù)結(jié)果可能不是實(shí)際菌落數(shù)的真實(shí)反映。因?yàn)榫鋽?shù)過少的試紙片（少于25 CFU），稀釋因子可能會(huì)夸大計(jì)數(shù)結(jié)果；二菌落數(shù)過多的試紙片（超過250 CFU），一反面因?yàn)殡y以計(jì)數(shù)，另一方面因?yàn)闀?huì)抑制某些細(xì)菌的生長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果低于實(shí)際菌數(shù)。報(bào)告時(shí)，將少于25 CFU或者多于250 CFU的試紙片計(jì)數(shù)結(jié)果報(bào)告為試紙片菌落計(jì)數(shù)的估計(jì)值（EAPC）。a） 菌落數(shù)在25250 CFU正常范圍內(nèi)的試紙片：選擇無(wú)

7、蔓延菌落的平板，技術(shù)所有菌落，包括那些極微小的菌落，記錄下計(jì)數(shù)的每個(gè)試紙片的菌落數(shù)和稀釋倍數(shù)。計(jì)算公式：如表2表2結(jié)果修約后為2.4×104或者24000 CFU/mL(g)b） 超過250 CFU的試紙片：所有稀釋度試紙片上菌落數(shù)都超過250 CFU，對(duì)于接近250 CFU的試紙片，先劃出分布具有代表性的區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)，再計(jì)算出整塊的菌落數(shù)，用EAPC來(lái)報(bào)告計(jì)算出的需氧菌落數(shù)，以表明該數(shù)值是從25250 CFU范圍外試紙片得出的估計(jì)值。其余試紙片都記錄為“多不可計(jì)”（TNTC）。如表3。c） 小于25 CFU的試紙片：所有測(cè)試片上菌落數(shù)都小于25 CFU，記錄測(cè)試片實(shí)際的菌落數(shù)，但報(bào)

8、告結(jié)果為小于25×（1/d），d為該計(jì)數(shù)的樣品的最低稀釋度的稀釋因子。如表4。表4d） 無(wú)菌落生長(zhǎng)的試紙片。如果所有稀釋度的試紙片都沒有菌落生長(zhǎng)，則APC報(bào)告為小于1乘以樣品的最低稀釋倍數(shù)，報(bào)告時(shí)將計(jì)算出的APC值標(biāo)上星號(hào)，以表明該數(shù)值是從25250 CFU范圍外試紙片得出的估計(jì)值。六、原始數(shù)據(jù)記錄表菌落總數(shù)原始記錄樣品編號(hào)樣品名稱樣品狀態(tài)固態(tài)，無(wú)異常 液態(tài)，無(wú)異常 其他：樣品數(shù)量溫 度濕 度%檢驗(yàn)方法檢測(cè)地點(diǎn)4 主要檢測(cè)儀器名稱及編號(hào)JM023 DHG-9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 JM049 GHP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱JM010 TD型電子天平 設(shè)備狀態(tài)正常 其他：檢驗(yàn)項(xiàng)目測(cè)試數(shù)據(jù)記錄計(jì)算公式檢驗(yàn)結(jié)果菌落總數(shù)CFU/ml(g)培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間及溫度平板計(jì)數(shù)瓊脂、36±1、