抗人VEGF的單克隆抗體對乳腺癌生長及轉(zhuǎn)移的影響

1、    抗人VEGF 的單克隆抗體對乳腺癌 生長及轉(zhuǎn)移的影響        【 摘要 】目的用具有中和活性的抗人血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）單抗進行抑瘤動物實驗，探討VEGF在腫瘤生長及轉(zhuǎn)移中的作用。 方法采用雜交瘤技術(shù)制備抗VEGF的單抗，經(jīng)親和層析純化單抗,在IVT2 MA-891津白II小鼠自發(fā)乳腺癌伴肺轉(zhuǎn)移動物模型中進行實驗研究。 結(jié)果D7、E5、G1、C5、D11及H5

2、6株單抗都能顯著地抑制腫瘤的肺轉(zhuǎn)移，對肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)的抑制率分別為44%，45%，62%，70%，72%和74%。對肺轉(zhuǎn)移灶大小的抑制率為79%100%。其中D7、C5、G1、D11 4株單抗也能明顯地抑制原發(fā)瘤的生長。其抑制率分別為41%，46%，53%和83%。結(jié)論VEGF單抗能阻斷腫瘤血管的形成，顯著地抑制原發(fā)瘤的生長和轉(zhuǎn)移，在腫瘤的治療中顯示出潛在的應(yīng)用價值?！?主題詞 】血管內(nèi)皮生長因子抗體，單克隆腫瘤轉(zhuǎn)移疾病模型，動物 Inhibition of tumor growth and metastasis by neutralizing monoclonal antibodies to h

3、uman vascular endothelial growth factor 165 YANG Zhihua, WANG Guiqi, YANG Fangsheng, et al. Cancer Institute, CAMS, PUMC, Beijing 100021【 Abstract 】ObjectiveTo study the inhibitory effects of the neutralizing monoclonal antibodies (McAb) against human vascular endothelial growth factor (VEGF) 165 on

4、 primary and metastases tumor growth of breast cancer in IVTA2MA-891 murine model. MethodsNeutralizing McAb to human VEGF165 were prepared with hybridoma technology and purified with affinity column. After inoculated with breast tumor cell, TA2×615 F1 mice were divided in to groups and injected

5、 in the right rear leg respectively with PBS and neutralizing anti-VEGF McAb at a dose of 250g/mouse/day from day 3 to 22. All the mice were sacrificed on day 27. ResultsPrimary tumor growth was inhibited by 83%, 53%, 47% and 41% respectively for McAb D11, G1, H5 and D7. The numbers of metastatic fo

6、ci in lung of mice were suppressed by 44%, 55%, 62%, 70%, 72% and 74%, respectively for anti-VEGF McAb D7, E5, G1, C5, D11 and H5. The size of metastatic foci were inhibited by 80%, 82%,79%,100%, 100% and 100%, respectively. ConclusionsNeutralizing anti-VEGF165 McAbs significantly suppressed the gro

7、wth and metastasis of breast cancer and may have therapeutic potential for human cancers.【 Subject words 】Vascular endothelial growth factorAntibody，monoclonal Tumor metastasisDisease model,animal已有的研究表明，幾乎所有實體腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移均依賴于腫瘤血管的形成1。實體瘤的生長通常分為無血管期和血管期。即腫瘤長至直徑12mm時，腫瘤分泌若干因子刺激血管形成，獲得血供的腫瘤繼續(xù)增大乃至轉(zhuǎn)移，因此通過阻斷

8、血管形成治療腫瘤的新策略近年來倍受關(guān)注。腫瘤血管形成受多種因子調(diào)節(jié)，其中具有重要實際意義的是VEGF2,3。它能刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖，促進血管形成及血管內(nèi)成分的滲漏，也能促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。絕大多數(shù)實體瘤都高表達VEGF，而正常組織極少表達4。其表達水平與腫瘤血管密度、腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)57。為此我們研制了抗人VEGF的單抗，獲得9株具有中和活性的單抗并對其中6株單抗進行了抑瘤的實驗動物研究，探討了VEGF在腫瘤生長及轉(zhuǎn)移中的作用以及VEGF單抗治療腫瘤的可能應(yīng)用價值。材料與方法1. 動物：IVTA2MA-8918原為348日齡雌性津白II型小鼠自發(fā)乳腺腫物，經(jīng)同源小鼠反復(fù)傳代，獲得高

9、自發(fā)性肺結(jié)節(jié)性轉(zhuǎn)移模型，病理證實為小鼠乳腺癌Dunn類B型。2. 單抗的制備及純化：以DNA重組技術(shù)原核表達的人VEGF165蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠，按常規(guī)雜交瘤技術(shù)獲得陽性克隆。經(jīng)生物學(xué)特性鑒定后，將穩(wěn)定傳代和穩(wěn)定分泌VEGF單抗的雜交瘤細胞腹腔注射BALB/c小鼠制備腹水。腹水經(jīng)50%飽和硫酸銨沉淀粗提，PBS透析后，再經(jīng)Protein A Sepharose-4B Fast Flow柱層析純化。3. 血管內(nèi)皮細胞及腫瘤細胞增殖測定(HuVEC)：按楊小平等9的方法加以改進，將人臍帶靜脈血管內(nèi)皮細胞，培養(yǎng)于96孔板中，4×103細胞/孔。48小時后加入10ng/ml VE

10、GF與不同濃度單抗的反應(yīng)物，每一抗體濃度3個平行孔，設(shè)無關(guān)抗體HIT和內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液對照，37，5% CO2培養(yǎng)5天后，加3H-TdR，37kBq/孔。6小時后收集細胞，Beckman L5-380/型液閃儀測cpm值。用同樣方法測定VEGF抗體對人乳腺癌細胞系MCF7生長的作用。4. 血管通透性測定(Miles)：以Miles10豚鼠皮膚血管通透性實驗測定單抗抑制VEGF血管滲漏活性。經(jīng)豚鼠頸靜脈注射0.5Even's blue，30分鐘后在豚鼠背部皮膚皮內(nèi)注射200ng VEGF抗原與不同濃度單抗的反應(yīng)物，設(shè)VEGF抗原和PBS對照，15分鐘后觀察注射局部皮膚藍斑的形成及大小。5.

11、 動物實驗的分組設(shè)計：將IVTA2MA-891腫瘤研磨成細胞懸液，皮下接種于IVTA2津白型小鼠與615小鼠雜交的F1雌性小鼠右后腿。每只接種105細胞/0.1ml，3天后隨機分組進行抗體治療，設(shè)單抗治療組和PBS對照組，每組6只小鼠。單抗治療組每天每只小鼠注射純化單抗250g/0.2ml，PBS組每天每只小鼠腹腔注射0.2mlPBS，每天1次，連續(xù)注射20天。當(dāng)腫瘤可觸及時，每隔3天測量腫瘤的長軸（L）及短軸（W），并計算腫瘤的體積。停藥后5天處死動物，稱瘤重、肺重，檢測肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目及大小。6株單抗分兩批實驗進行。結(jié)果1. VEGF單抗的制備及中和活性測定：以DNA重組技術(shù)原核表達人VEGF

12、165多肽為抗原，免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)，獲得了14株穩(wěn)定分泌抗人VEGF的單抗雜交瘤株，HuVEC和Miles實驗分別測定了6株單抗的中和活性。結(jié)果如1。6株單抗都能明顯地抑制10ng/ml VEGF抗原對HuVEC細胞的增殖，且呈劑量依賴關(guān)系，當(dāng)單抗?jié)舛却笥?0g/ml時，VEGF促血管內(nèi)皮細胞增殖的活性被抑制70%以上。其中D11單抗抑制能力最強。其抑制率達85%。但當(dāng)這些單抗加到人乳腺癌細胞系MCF7中，即使在最大抗體濃度時（100g/ml）,對MCF7 細胞的生長仍無抑制作用，不加單抗只加10g/ml VEGF抗原組也未見到乳腺癌細胞的增殖（這表明VEGF特異促進血管內(nèi)

13、皮細胞增殖，對腫瘤細胞無作用。VEGF單抗特異地中和VEGF的生物活性，對腫瘤細胞生長無任何作用）。Miles實驗檢測VEGF單抗對200ng/ml VEGF抗原促血管通透活性的結(jié)果如表1。6株106cells/ml雜交瘤培養(yǎng)上清在濃度為11時，能完全抑制VEGF抗原的促血管滲漏活性。其中G1、H5、D11、C5 4株單抗抑制活性較高，當(dāng)培養(yǎng)上清稀釋為11 000時，仍具有抑制VEGF促血管滲漏活性。1VEGF 單抗對HuVEC細胞生長的抑制作用Fig1. The effect of anti-VEGF McAb on the in vitro growht of HuVEC cells in

14、duced by VEGF表1VEGF單抗對血管通透性的抑制作用Table 1. Inhibition of the in vivo vascular permeability enhancing activity of VEGF by anti-VEGF McAbsConcentration*of McAbsD11G1C5D7E5H511+110+1100+-+11 000+-+-+*Dilution of supernatants of cultured 106 hybridoma cells secreting anti-VEGF McAbs2. VEGF單抗對乳癌原發(fā)瘤的影響：6株單抗

15、對小鼠乳癌原發(fā)瘤的生長有明顯抑制作用。PBS對照組平均于腫瘤細胞接種后第6天觸及腫瘤，而單抗治療組平均遲至1214天，停藥后腫瘤生長趨勢雖有所恢復(fù)，但仍明顯緩于PBS對照組（資料略）。接種腫瘤27天后處死動物，稱取瘤重，結(jié)果如表2，其中D11、G1、H5 、D7 4株單抗對原發(fā)瘤的抑制率分別為83%，53%，47%，41%，以D11抑制作用最強。表2VEGF 單抗對自發(fā)性乳癌原發(fā)瘤的作用Table 2. The effect of anti-VEGF McAbs on primary tumors of spontaneous breast cancerGroupIncidenceof tum

16、orTumor weight(±s,g)Inhibitionrate(%)PvalueExp 1PBS6/61.33±0.46-H56/60.71±0.0446.6<0.05D76/60.78±0.1941.1<0.05C56/61.22±0.408.2>0.05Exp 2PBS6/62.05±0.34-D116/60.34±0.1383.4<0.001G16/60.96±0.4852.8<0.01E56/62.02±1.110.0>0.053. VEGF單抗對乳癌肺轉(zhuǎn)

17、移的影響：28天處死動物，雖然所有實驗動物均發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，但VEGF單抗治療組肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)均顯著低于PBS對照組，6株單抗均有明顯抑制肺轉(zhuǎn)移的作用，其抑制率分別為70.2%，44.2%，74.2%，61.9%，71.9%和54.9%（表3）。依肺轉(zhuǎn)移灶的大小計，VEGF單抗治療組直徑大于0.5mm的轉(zhuǎn)移灶數(shù)為24個，遠遠少于PBS對照組的1415個，其中D11、H5、C5 3株單抗對轉(zhuǎn)移灶大小的抑制率均為100%(表4)。 表3VEGF 單抗對自發(fā)性乳癌肺移灶數(shù)目的影響Table 3. The effect of anti-VEGF McAbs on number of metastic foci

18、 in the lung of murine spontaneous breast cancersGroupIncidenceof tumorNo.foci(±s)Inhibitionrate(%)PvalueExp 1PBS6/654.20±11.13-H56/614.03±3.1674.2<0.01D76/630.21±10.8044.2<0.05C56/616.34±5.2870.2<0.01Exp 2PBS6/654.05±14.51-D116/615.25±2.0371.9<0.01G16/

19、620.60±7.6761.9<0.01E56/629.80±3.3154.9<0.05表4VEGF 單抗對自發(fā)性乳癌肺轉(zhuǎn)移灶大小的影響Table 4. The effect of anti-VEGF McAbs on size of metastatic foci in the lung of murine spontaneous breast cancersGroupIncidence ofmetastasisNo.metastasis(size>0.5mm ±s)Inhibitionrate(%)PvalueExp 1PBS6/614.90

20、±4.15-H56/60100<0.001D76/63.16±1.0380.2<0.001C56/60100<0.001Exp 2PBS6/615.50±3.35-D116/60100<0.001G16/63.33±2.1378.5<0.001E56/62.81±3.3481.9<0.001討論我們曾用32P-dCTP標(biāo)記的人VEGF cDNA探針以及用抗人VEGF的多抗分別進行Northern雜交及免疫組化染色。結(jié)果顯示，IVTA2MA-891乳癌的原發(fā)瘤和肺轉(zhuǎn)移灶中均有VEGF mRNA和蛋白的陽性表達。

21、以肺轉(zhuǎn)移灶表達最高。這表明該動物模型的原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移灶表達的VEGF與人VEGF有明顯的同源性。 我們應(yīng)用原核表達的重組VEGF蛋白作為抗原，制備了抗人VEGF的單抗，對其中6株進行了體內(nèi)外中和活性測定及體內(nèi)動物實驗研究。結(jié)果表明，具有中和活性的VEGF單抗確能顯著抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。這種抑制作用不是抗體直接作用于腫瘤細胞所致。6株單抗的體外中和活性與體內(nèi)抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用比較發(fā)現(xiàn)，這些單抗抑制腫瘤生長轉(zhuǎn)移的作用與其中和活性密切相關(guān)。D11、C5、H5 3株單抗抑制血管滲漏的中和活性較高，其抑制腫瘤肺轉(zhuǎn)移的抑制率也較高，均在70%以上。腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移以及能否預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移是提高腫瘤

22、病人生存率的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療等腫瘤治療手段都以腫瘤細胞及組織為直接殺傷對象，對原發(fā)瘤的治療有明顯效果，但不能有效地阻斷腫瘤的轉(zhuǎn)移。采用該動物模型于接種腫瘤后第3天，分別給予7種抗腫瘤化療藥物進行治療，這些化療藥物對原發(fā)瘤的抑制率最高達90%，但對轉(zhuǎn)移的抑制率除平陽霉素為42%外，其余6種藥物的抑制率均不足30%8 。但6株VEGF單抗抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用均高于這些化療藥物。體外試驗顯示，VEGF單抗對乳腺癌細胞的生長無抑制作用。因此該抗體在體內(nèi)抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用不是直接抑制腫瘤細胞生長所致，而是通過抑制新生血管內(nèi)皮細胞增殖、阻斷腫瘤血管形成來實現(xiàn)的。這種抗血管療法的策略與化療相比

23、具有諸多優(yōu)點：（1）克服了以腫瘤細胞為靶的化療藥物不易進入腫瘤組織或腫瘤細胞發(fā)揮有效殺傷作用的缺點。（2）毒副作用低，重復(fù)應(yīng)用不易產(chǎn)生耐藥性。（3）成千上萬的腫瘤細胞依賴于同一血管獲取營養(yǎng)，阻斷血管形成將使大量的腫瘤細胞死亡，療效顯著。（4）具有廣譜性。所有的實體瘤都以相同的類型和方式依賴于血管形成而生長，因此，一種腫瘤血管形成阻斷劑可用于多種腫瘤的治療。但在試驗中發(fā)現(xiàn)，停藥后腫瘤可再生長，其原因是阻斷腫瘤血管形成的治療只能使腫瘤縮小到休眠狀態(tài)，并非徹底殺滅腫瘤細胞。因此，如果將抗腫瘤血管形成的單抗與直接殺傷腫瘤細胞的化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，從兩種途徑抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，將會顯著地提高治療腫瘤及防

24、止其轉(zhuǎn)移的療效。有關(guān)這方面的研究正在進行之中。 作者單位：100021 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，腫瘤研究所參考文獻1 Folkman J. Angiogenesis in cancer vascular rheumatoid and other disease. Nature Med, 1995 ,127-31.2Presta LG, Chen HO, Connor SJ, et al. Humanization of an anti-vascular endothelial growth factor monoclonal antibody for therapy of so

25、lid tumors and other disorders. Cancer Res, 1997,574593-4599.3Tokunaga T. Vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA isoform expression pattern is correlated with liver metastasis and poor progenosis in colon cancer. Br J Cancer, 1998,77998-1002.4Georg MB, Dieter Marme. VEGF-mediated tumor angiogenesis: A new target for cancer therapy. Current O