基質金屬蛋白酶在心肌肥厚大鼠細胞外基質重塑中的作用及氯沙坦干

1、基質金屬蛋白酶在心肌肥厚大鼠細胞外基質重塑中的作用及氯沙坦干預         作者：白江濤 陸鳳翔 許迪 陳莉 周蕾 雍永宏 【關鍵詞】 心肌肥厚 Role of metalloproteinases in rat cardiac extracellular matrix remodeling and effects of losartan on it 【Abstract】 AIM: To investigate the role of metalloproteinase (MMP9), tissue inhib

2、         ; 作者：白江濤 陸鳳翔 許迪 陳莉 周蕾 雍永宏 【關鍵詞】; 心肌肥厚 Role of metalloproteinases in rat cardiac extracellular matrix remodeling and effects of losartan on it 【Abstract】 AIM: To investigate the role of metalloproteinase (MMP9), tissue inhibitor of metalloproteinase (T

3、IMP1) and transforming growth factor1 (TGF1) in cardiac hypertrophy and extracellular matrix remodeling and the effects of Losartan on it in a rat model. METHODS:; Male SD rats were randomly divided into three groups: control group, norepinephrine group (1.06 mgkg-1d-1×15 d) and; norepinephrine

4、 + Losartan group (10 mgkg-1d-1×15 d). The rat cardiac hypertrophy models were established by intraperitoneal injection of norepinephrine (NE) twice a day for 15 days. Cardiac hypertrophy and extracellular matrix remodeling were evaluated by echocardiography and morphological examination. The m

5、RNA and protein expression of matrix; metalloproteinase (MMP9), tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP1) and transforming growth factor1 (TGF1) was examined by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) and immunohistochemical analysis. RESULTS:; NEinduced hypertrophy and extracellu

6、lar matrix remodeling predominantly occurred in the left ventricular and the mRNA and protein expression of the MMP9, TIMP1 and TGF1 elevated (P<0.01). After Losartan treatment, the interventricular septal thickness, total collagen, type I, type III collagen and the expression of MMP9 and TGF1 de

7、creased (P<0.01). CONCLUSION: MMP9, TIMP1 and TGF1 are involved in the cardiac extracellular matrix remodeling induced by NE. Losartan can prevent the cardiac hypertrophy and extracellular matrix remodeling, which is associated with the attenuation of myocardial MMP9 and TGF1. 【Keywords】 cardiac

8、hypertrophy; extracellular matrix; metalloproteinase; Losartan 【摘要】 目的： 探討基質金屬蛋白酶(MMP9)及其生理性抑制劑TIMP1和轉化生長因子1（TGF1）在心肌肥厚大鼠細胞外基質重塑中的作用及氯沙坦干預的效果. 方法： 雄性SD大鼠隨機分為3組：對照組;去甲腎上腺素(norepinephrine, NE)組（1.06 mgkg-1d-1×15 d）;NE+氯沙坦組（10 mgkg-1d-1×15 d）. NE腹腔注射，2次d-1，連續(xù)15 d，建立心肌肥厚的模型. 應用超聲心動圖及病理學方法評價整體心

9、肌肥厚和組織膠原的表達. 用逆轉錄聚合酶鏈反應法（RTPCR）及免疫組化方法檢測MMP9, TIMP1和TGF1 mRNA和蛋白表達情況. 結果：大鼠腹腔注射NE后發(fā)生左心室肥厚及纖維化，膠原的含量及MMP9, TIMP1和TGF1的蛋白、mRNA的表達顯著高于健康對照組（P<0.01）. 氯沙坦能降低室間隔的厚度，減少左室心肌中總體膠原、I型、III型膠原的合成及MMP9,TGF1的表達（P<0.01）. 結論： MMP9, TIMP1和TGF1與NE誘導的心肌細胞外基質重塑有關. 氯沙坦能有效的防治心肌肥厚及細胞外基質重塑,這一效應與其降低心肌中高表達的MMP9和TGF1有關.

10、 【關鍵詞】 心肌肥厚；細胞外基質；基質金屬蛋白酶；氯沙坦 0引言 基質金屬蛋白酶（metalloproteinases, MMPs）是一類包含鋅離子的內源性蛋白水解酶，是細胞外基質（ECM）的主要生理調節(jié)因子. 最近研究發(fā)現(xiàn)，MMPs在心梗后心衰的發(fā)病機制中具有重要的作用1. 轉化生長因子（TGF1）被證實能促進組織纖維化和ECM積聚，. 有關延緩或防止心肌重塑的發(fā)展及其相關機制的研究，一直是心血管領域的熱點. 我們旨在探討MMP9及其生理性抑制劑TIMP1和TGF1在大鼠心肌肥厚及細胞外基質重塑過程中的作用及氯沙坦的防治作用. 1材料和方法 1.1材料動物模型及分組： 雄性SD大鼠25只（

11、南京醫(yī)科大學動物實驗中心），體質量250280 g，隨機分為3組: 對照組（n=8）；去甲腎上腺素組(norepinephrine, NE) (n=8)；NE+氯沙坦（默沙東公司）(n=9). NE注射液1.06 mgkg-1d-1, 腹腔注射,2次d-1，連續(xù)給藥15 d，制備心肌肥厚模型，對照組腹腔注射生理鹽水及蒸餾水灌胃. 氯沙坦10 mgkg-1d-1早晨1次灌胃給藥，療程15 d. 1.2方法 L-1甲醛液固定，石蠟包埋，4 m切片. VanGieson(VG)染色法使膠原特殊染色，光鏡檢查，心肌細胞呈黃色，膠原呈紅色，并用全自動圖像分析儀行圖像處理. 每個標本選一個切片，測量左心室

12、心肌的膠原容積分數(shù)(CVF)(左心室膠原面積/所測視野面積). 隨機取4個視野，以均值作為該心臟的CVF. L-1過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，熱修復抗原后，100 mLL-1正常山羊血清封閉非特異性抗原. 滴加一抗（1100稀釋）（購自武漢博士德生物公司），4過夜. 滴加生物素標記的二抗；37孵育30 min；滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液；DAB顯色，封片. 以TBS代替一抗作陰性對照. 應用多功能彩色圖像分析系統(tǒng)對I型和III型膠原（心肌細胞間隙及血管周圍棕色條紋）、MMP9, TIMP1, TGF1蛋白（細胞質中棕褐色顆粒為陽性）表達進行圖像分析，表達強度用平均灰度值表示. L-1

13、dNTP 1 L,RNAase抑制劑0.5 L,MMLV逆轉錄酶 L(美國Promega),5×MMLV緩沖液2 L, DEPC水1.5 L, 42 60 min, 95 5 min終止反應. 合成的cDNA 4保存. 聚合酶鏈反應：Eppendorf管中依次加入cDNA 1 L,10×PCR緩沖液2 L,上下游引物各0.5 L, MgCl2 0.3 L,Taq DNA聚合酶0.3 L,10 mmolL-1 dNTP 0.3 L,雙蒸水14.2 L. 95變性30 s,退火30 s，72延伸1 min, MMP9的退火溫度為59,最適循環(huán)數(shù)為28個循環(huán)；TIMP1的退火溫度為60,最適循環(huán)數(shù)為32個循環(huán)；TGF1的退火溫度為55,最適循環(huán)數(shù)為30個循環(huán). 72延伸7 min. 取上述PCR產