分子生物學(xué)技術(shù)在土壤污染治理中的應(yīng)用

1、分子生物學(xué)技術(shù)在土壤污染治理中的應(yīng)用摘要 IAbstract II第1章 緒論 11.1 土壤污染 11.2 土壤污染修復(fù) 11.3土壤污染修復(fù)中的分子生物學(xué)技術(shù) 2 21. 3.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 21. 3.3電泳分離純化技術(shù) 3第2章 分子生物學(xué)技術(shù)在重金屬污染土壤治理中的應(yīng)用 52.1 分子生物學(xué)在汞（Hg）污染土壤治理方面的應(yīng)用 52.2分子生物學(xué)在砷（As）污染土壤治理方面的應(yīng)用 6第3章 分子生物學(xué)技術(shù)在石油污染土壤治理中的應(yīng)用 8第4章 分子生物學(xué)技術(shù)在農(nóng)藥和除草劑污染土壤中的應(yīng)用 10第5章 總結(jié)及展望 11參考文獻(xiàn) 12摘要相對(duì)水和大氣污染等污染類型，土壤污染具有潛伏性、隱蔽

2、性、長期性和不可逆性等特點(diǎn)，治理難度較大。此外，土壤污染的類型多樣，包括農(nóng)藥和除草劑污染、重金屬污染和石油污染等，這就進(jìn)一步加大了土壤修復(fù)的難度。而分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得越來越多的抗污染微生物得以鑒定，越來越多的與微生物降解和轉(zhuǎn)化以及植物超富集有關(guān)的基因被發(fā)現(xiàn)，并且得到加強(qiáng)。本文分別介紹了分子生物學(xué)技術(shù)在土壤重金屬污染、石油污染和農(nóng)藥與除草劑污染治理方面的應(yīng)用，重點(diǎn)關(guān)注了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、電泳分離、基因工程和16S rDNA序列分析等技術(shù)在土壤污染的微生物修復(fù)和植物修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用。關(guān)鍵詞：土壤污染；分子生物學(xué)技術(shù)；微生物修復(fù)；植物修復(fù)AbstractThe pollution of

3、soil is characterized by its latency, hidden nature, long-term property and irreversibility with comparison to water and air pollutions. Furthermore, the diversity of pollutions of soil including pollutions of pesticide, herbicide, heavy metal and petroleum increases the difficulty of the remediatio

4、n of pollutant soil. However, increasing microorganisms resistant to contaminates were identified with molecular biology technology, and genes of hyper-accumulation in plant and degradation and transformation in microorganisms were found and strengthened. The application of molecular biology technol

5、ogy in the restoration of soil polluted by heavy metal, petroleum and pesticide and herbicide were introduced with the highlight of the using of polymerase chain reaction (PCR, electrophoresis, genetic engineering and analysis of 16S rDNA sequence in the bioremediation and phytoremediation.Key words

6、: soil contamination, molecular biology technology, phytoremediation, bioremediation第1章 緒論1.1 土壤污染由于人類的活動(dòng)，使得污染物進(jìn)入土壤并積累到一定程度，引起土壤環(huán)境質(zhì)量惡化，對(duì)生物、水體、空氣和人體健康造成危害的現(xiàn)象即土壤污染1。相對(duì)于其它環(huán)境介質(zhì)污染，土壤污染具有隱蔽性或潛伏性、土壤對(duì)污染物有富集作用、土壤污染具有長期性和不可逆性、土壤污染后果的嚴(yán)重性等2。造成土壤污染的主要原因包括過量使用化學(xué)肥料、過量使用化學(xué)農(nóng)藥和除草劑、固體廢物的隨意堆放和廢水灌溉等第3?；士纱蠓鹊奶岣咿r(nóng)產(chǎn)品的數(shù)量和質(zhì)量

7、，但化肥的過量使用既是資源的浪費(fèi)，又是造成當(dāng)前生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重污染的主要原因之一?；瘜W(xué)農(nóng)藥和除草劑對(duì)提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力做出了很大的貢獻(xiàn)，但在消滅病害蟲和雜草的同時(shí)，也會(huì)使有益于農(nóng)業(yè)的微生物、昆蟲和鳥類遭受毒害，同時(shí)會(huì)使害蟲產(chǎn)生抗藥性；而且許多化學(xué)農(nóng)藥（包括除草劑）屬于內(nèi)分泌干擾素（EDCs），具有環(huán)境激素效應(yīng)，能對(duì)人和動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生干擾，從而影響生殖機(jī)能，造成雌性化及后代生命力退化4-5。礦業(yè)、工業(yè)固體廢物的隨意堆放導(dǎo)致附近土壤中某些有毒元素尤其是重金屬元素的含量超出一般土壤的含量，這些重金屬在環(huán)境中不會(huì)降解、消失，只能遷移、轉(zhuǎn)化，對(duì)環(huán)境質(zhì)量和農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)產(chǎn)生很大的影響6，若進(jìn)

8、入人體內(nèi)，體內(nèi)的有關(guān)蛋白酶活性受到抑制，或是與體液中的某些離子及蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)生沉淀反應(yīng)，在體內(nèi)得到聚集濃縮，干擾機(jī)體的正常發(fā)育，最終導(dǎo)致各種疾病乃至腫瘤的形成。直接使用污染的地表水進(jìn)行灌溉，會(huì)將污水中的有害物質(zhì)帶入農(nóng)田，改變土質(zhì)和土壤結(jié)構(gòu)，影響土壤中微生物活動(dòng)，妨礙植物根系生長，影響作物產(chǎn)量及品質(zhì)，進(jìn)而危害到人類健康。1.2 土壤污染修復(fù)目前用于土壤污染修復(fù)的技術(shù)包括土壤清洗、離子交換、沉淀固定、微生物修復(fù)和植物修復(fù)等。近幾年，與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的微生物修復(fù)和植物修復(fù)技術(shù)越來越受重視。土壤生物修復(fù)技術(shù)是利用土壤中的天然微生物資源或人為添加的目的菌株，甚至是構(gòu)建的特異降解功能菌株，將滯留的污

9、染物降解和轉(zhuǎn)化成無害的物質(zhì)，使土壤恢復(fù)其天然功能7。微生物修復(fù)可分為原位生物修復(fù)和異位生物修復(fù)。原位生物修復(fù)是指對(duì)受污染的介質(zhì)(土壤、水體不作搬運(yùn)或輸送，而在污染地進(jìn)行的生物修復(fù)處理，修復(fù)過程主要依賴于被污染地自身微生物的自然降解能力和人為創(chuàng)造的合適降解條件；異位生物修復(fù)是指將被污染介質(zhì)(土壤、水體搬運(yùn)和輸送到它處進(jìn)行生物修復(fù)處理8。植物修復(fù)技術(shù)是利用植物對(duì)污染物質(zhì)的吸收、富集和轉(zhuǎn)化能力把土壤中殘存的污染物吸收、富集到植物體內(nèi)，然后收獲植物，從而減少土壤中污染物的含量，實(shí)現(xiàn)環(huán)境修復(fù)的目標(biāo)9。重金屬污染是土壤環(huán)境污染的重要方面，如何消除土壤環(huán)境中的重金屬污染物已成為國際性難題，而植物修復(fù)技術(shù)的出

10、現(xiàn)和快速發(fā)展為我們展示了一條新的希望之路。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)越來越多的被引入到土壤污染治理及檢測(cè)的研究中。越來越多的耐污染微生物得到分離和鑒定，越來越多的修復(fù)性蛋白的基因正被從植物、微生物和動(dòng)物中陸續(xù)分離出來。通過改造這些基因的結(jié)構(gòu)，采用更強(qiáng)的啟動(dòng)子，并將其轉(zhuǎn)移到受體植物或微生物，可以大幅度地提高植物對(duì)重金屬污染物的富集速率和最高富集程度，提高微生物降解污染物的能力。1.3土壤污染修復(fù)中的分子生物學(xué)技術(shù)10在土壤修復(fù)過程中用到的分子生物學(xué)技術(shù)主要有基因工程技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)和電泳分離純化技術(shù)等。基因工

11、程是指按照人為創(chuàng)造的藍(lán)圖，將某特定的基因，通過載體或其他手段送入受體細(xì)胞，通過一系列復(fù)雜的生物學(xué)過程(類似工程操作定向改造受體生物，使特定基因在受體細(xì)胞中增殖并表達(dá)的一種遺傳學(xué)操作。用基因工程的方法，可以不受物種親緣關(guān)系的限制而將一個(gè)外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，經(jīng)過基因重組、增殖并得到表達(dá)，產(chǎn)生新的基因產(chǎn)物?；蚬こ碳夹g(shù)在環(huán)境污染物處理中的應(yīng)用主要是應(yīng)用改良后的工程菌處理污染物，如處理石油污染、降解塑料污染等。1. 3.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)模仿生物體內(nèi)DNA的復(fù)制過程，首先使DNA變性，兩條鏈解開；然后使引物模板退火，二者堿基配對(duì)；耐高溫的DNA聚合酶即以4種堿基為底物，在引物的引導(dǎo)下

12、合成與模板鏈互補(bǔ)的DNA新鏈。PCR技術(shù)可在體外快速擴(kuò)增DNA，具有快速、簡便、靈敏度高的特點(diǎn)，能夠彌補(bǔ)DNA分子直接雜交技術(shù)的不足。PCR技術(shù)的產(chǎn)生是整個(gè)分子生物學(xué)領(lǐng)域的一次重大革命，發(fā)展極快，已衍生出一系列相關(guān)的生物技術(shù)。污染治理中應(yīng)用的基于PCR的技術(shù)主要有：（1）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（RT-PCR）：是在mRNA反轉(zhuǎn)錄之后進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，可以用來分析不同生長時(shí)期的mRNA表達(dá)狀態(tài)的相關(guān)性，探測(cè)和定量個(gè)體結(jié)構(gòu)基因表達(dá)。RT-PCR技術(shù)可用于檢測(cè)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，分析表達(dá)的水平，不需構(gòu)建和篩選cDNA文庫而能直接克隆cDNA產(chǎn)物，此技術(shù)用途廣泛且靈敏度高。（2）競爭PCR（C-PCR）：是一種

13、定量PCR，通過向PCR反應(yīng)體系中加入人工構(gòu)建的帶有突變的競爭模板、控制競爭模板的濃度來確定目的模板的濃度，對(duì)目的模板作定量研究。（3）AFLP標(biāo)記，先用限制酶消化DNA，然后連接上人工合成的雙鏈接頭，最后進(jìn)行PCR和電泳顯示。此技術(shù)是用一個(gè)短的隨機(jī)引物進(jìn)行PCR，模板DNA有多個(gè)擴(kuò)增子，可以擴(kuò)增出多個(gè)產(chǎn)物而可能出現(xiàn)多態(tài)現(xiàn)象。（4）擴(kuò)增的rDNA限制酶切分析技術(shù)（ARDRA），此技術(shù)依據(jù)原核生物rDNA序列的保守性，將擴(kuò)增的rDNA片段進(jìn)行酶切，然后通過酶切圖譜來分析菌間的多樣性，是美國最新發(fā)展起來的一項(xiàng)現(xiàn)代生物鑒定技術(shù)。（5）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（RAPD），這是一種基于PCR檢測(cè)PCR引物結(jié)

14、合位點(diǎn)的序列改變的方法。RAPD通常以10 bp的寡核苷酸序列為引物，對(duì)基因組DNA隨機(jī)擴(kuò)增，電泳分離染色擴(kuò)增產(chǎn)物，再分析多態(tài)性。1. 3.3電泳分離純化技術(shù)在外電場(chǎng)的作用下，帶電顆粒將向著與其電性相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。電泳技術(shù)是當(dāng)前核酸研究中最常用的方法，具有簡單、快速、靈敏、成本低等優(yōu)點(diǎn)。除了常用的瓊脂糖凝膠電泳-溴乙錠染色方法和聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染的方法外，還有一些通過特殊的電泳分離技術(shù)而建立的分子標(biāo)記。如單細(xì)胞凝膠電泳、變性梯度凝膠電泳等，都是通過施加不同染色體變性條件改變DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。由于不同序列的DNA片段變性時(shí)解鏈程度不同，在凝膠中電泳遷移速率不同，凝膠電泳后不

15、同序列的DNA片段在凝膠上得以高分辨率的分離，可用作各種分子標(biāo)記物的檢測(cè)。（1）單細(xì)胞凝膠電泳：包埋在瓊脂糖凝膠中的細(xì)胞在中性或堿性條件下經(jīng)裂解與解旋后，帶負(fù)電荷的DNA游離斷片在電場(chǎng)的作用下向陽極遷移。根據(jù)電泳條件，單細(xì)胞凝膠電泳可分為中性和堿性單細(xì)胞凝膠電泳。單細(xì)胞凝膠電泳除可檢測(cè)DNA單、雙鏈斷裂外，還可檢測(cè)DNA切除修復(fù)缺陷和DNA交聯(lián)、氧化性損傷等多種類型的DNA損傷，是探討遺傳毒性機(jī)理的有效工具。（2）變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）：變性梯度凝膠電泳是依靠變性劑使Tm值不同的分子分離。此技術(shù)分辨率高，但需

16、較長的凝膠和電泳時(shí)間。在變性梯度凝膠電泳技術(shù)應(yīng)用到分子微生物生態(tài)學(xué)后，已證明這類電泳技術(shù)是揭示自然環(huán)境中的生物群體遺傳多樣性的有效手段，可用于研究污染環(huán)境中的生物群落結(jié)構(gòu)及監(jiān)測(cè)環(huán)境變化。（3）溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）：溫度梯度凝膠電泳是依靠溫度梯度來分離Tm值不同的分子，是使用熱作為一種能量來源，使得氫鍵變得熱力學(xué)不穩(wěn)定，不同DNA片段由于Tm值不同將表現(xiàn)出不同的解鏈行為，從而使電泳遷移速率不同，而達(dá)到在溫度梯度電泳中分離的效果。第2章 分子生物學(xué)技術(shù)在重金屬污染土壤治理中的應(yīng)用重金屬通常是指密度大于5.0g

17、/cm3 的元素，元素周期表共有45種。砷（As）、硒（Se）是非金屬，但它們的毒性及某些性質(zhì)與重金屬相似，故亦列為重金屬污染物。目前環(huán)境污染研究方面的重金屬主要是一些生物毒性較大元素，如鎘（Cd）、鉛（Pb）、鉻（Cr）、汞（Hg）和 As，此外還包括鋅（Zn）、銅（Cu）、鉆（Co）、鎳（Ni）等植物微量元素等，因?yàn)檫@些元素在高濃度下同樣具有較大的生物毒性。隨著工業(yè)迅猛發(fā)展，大量的重金屬嚴(yán)重污染了農(nóng)田。我國大多數(shù)城市近郊土壤都受到了不同程度的重金屬污染11。重金屬可阻礙葉綠素、糖及蛋白質(zhì)合成，引起光合強(qiáng)度和呼吸強(qiáng)度下降，造成碳水化合物代謝失調(diào)及其它一系列生理代謝紊亂，最終導(dǎo)致生長量和產(chǎn)量的

18、下降。土壤重金屬可導(dǎo)致土壤微生物群落的變化，呈現(xiàn)出隨濃度上升而遞減的趨勢(shì)。而且進(jìn)入土壤中的重金屬對(duì)微生物酶活性有很大的影響。隨著重金屬污染的加劇，人們對(duì)重金屬污染治理放方面的研究越來多。在研究的過程中，人們分離出各種耐重金屬的微生物，發(fā)現(xiàn)了眾多超富集植物。近些年，隨著PCR、DGGE、基因工程等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的乃重金屬微生物得到鑒定，越來越多的抗重金屬基因被發(fā)現(xiàn)和分離。而且利用基因工程等技術(shù)，將重金屬抗性基因轉(zhuǎn)入特定的微生物或植物體內(nèi)，可使其獲得降解或超富集重金屬的能力。下面重點(diǎn)介紹分子生物學(xué)技術(shù)在治理Hg和As污染土壤方面的應(yīng)用。2.1 分子生物學(xué)在汞（Hg）污染土壤治理方面

19、的應(yīng)用許多微生物體內(nèi)存在一條轉(zhuǎn)化汞的反應(yīng)通路，其中有兩個(gè)關(guān)鍵性的酶：有機(jī)汞裂解酶(由merB基因編碼，將有機(jī)汞轉(zhuǎn)化為汞離子（Hg2+）；汞離子還原酶(由merA基因編碼，將Hg2+還原為基態(tài)汞（Hg0）。Meagher和他的同事對(duì)merA基因的序列進(jìn)行了改造，使之盡可能地符合真核基因的堿基組成，之后將該基因連接到植物啟動(dòng)子上并轉(zhuǎn)入擬南芥。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該植株對(duì)Hg2+的抗性及Hg0的揮發(fā)量都明顯地高于野生型植株12。He等采用葉圓片法將經(jīng)過人工改造的merA（merApe9）基因?qū)霟煵?Nicotiana tabacum。結(jié)果顯示，merApe9基因已整合入煙草染色體中，并且得到了表達(dá)。merA

20、pe9轉(zhuǎn)基因植物的種子在HgCl2濃度為50mol/L的培養(yǎng)基上能夠發(fā)芽，移栽后能正常生長，其中10%20%的轉(zhuǎn)基因株系抗HgCl2，其種子在HgCl2濃度為350mol/L的培養(yǎng)基上也能發(fā)芽。與merA轉(zhuǎn)基因植物相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化merB得到的轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)有機(jī)汞表現(xiàn)較強(qiáng)的抗性，在水培條件下，有些轉(zhuǎn)基因株系在含2.5 mol/L的醋酸苯汞(phenylmercuric acetate，PMA營養(yǎng)液里正常生長，而0.1 mol/L的PMA就可以殺死野生型煙草的幼苗13。細(xì)菌merA、merB基因在植物中的成功轉(zhuǎn)化并表達(dá)以及轉(zhuǎn)雙基因植株抗性比轉(zhuǎn)單基因更強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是基因工程應(yīng)用實(shí)踐中的一次重大突

21、破，它們?yōu)閷⒓?xì)菌中的抗重金屬反應(yīng)通路成功引入植物中提供了很好的模式和借鑒經(jīng)驗(yàn)。采用相似的方法，將merA、merB基因引入其它植物物種中也已產(chǎn)生汞揮發(fā)性植株。轉(zhuǎn)入merA和merB的鵝掌楸（Liriodendron tulipifera）和印度大麻（Cannabis）均表現(xiàn)出汞抗性的增強(qiáng)14-17。對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植株的植物修復(fù)潛在能力的初步實(shí)驗(yàn)分析也得到了可喜的結(jié)果，與對(duì)照植株相比，轉(zhuǎn)merA的煙草修復(fù)能力提高了34倍，在不到1周的時(shí)間內(nèi)，液體培養(yǎng)基中汞離子濃度由5mol/L降到了1mol/L18。2.2分子生物學(xué)在砷（As）污染土壤治理方面的應(yīng)用Achour等從2個(gè)土壤樣品中篩選出41個(gè)砷抗性

22、菌種并克隆出其亞砷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子基因片段，其中70.7%的抗性種包含arsB或ACR3基因。系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析顯示，arsB基因主要出現(xiàn)在硬壁菌門（Firmicutes）和-變形菌（Gammaproteobacteria）中，而ACR3則主要出現(xiàn)在放線菌（Actinobacteria）和-變形菌（Alphaproteobacteria）中19。Anderson研究了新西蘭2個(gè)砷污染場(chǎng)地土壤中的微生物群落并從中分離出了17個(gè)抗性種，16S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn)，它們分屬于微小桿菌屬（Exiguobacterium）、氣單孢菌屬（Aeromonas）、綠膿桿菌（Bacillus Pseudomonas）、

23、埃希菌屬（Escherichia）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）20。Turpeinen等采用磷酸脂肪酸分析(PLFA法和16S rRNA末端限制性片段多態(tài)性分析(t-RFLP法研究了砷、鉻、銅復(fù)合污染土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)微生物多樣性降低，群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，一些具有較強(qiáng)抗性的種群如Acinetobacter、愛德華氏菌屬（Edwardsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、沙門氏菌（Salmonella）和沙雷氏菌屬（Serratia）的數(shù)量和活性增強(qiáng)21。研究者從沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palu

24、stris）中克隆了位于arsRM操縱子上的砷甲基化相關(guān)基因arsM，整合到砷敏感的E.coli基因組中，發(fā)現(xiàn)ArsM賦予As(敏感菌株砷抗性。arsM基因編碼一個(gè)約29656的蛋白質(zhì)酶腺苷甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶As（）-S-adenosylmethionine，可以連續(xù)地對(duì)As(進(jìn)行甲基化，其表達(dá)受ArsR編碼的阻遏蛋白的調(diào)控22。 Ellis等成功地從蜈蚣草的cDNA文庫中克隆出砷酸鹽還原酶基因（PvACR2），將該基因超量表達(dá)到酵母突變體菌株RM1中，能互補(bǔ)酵母砷酸鹽還原酶的功能，恢復(fù)突變體菌株RM1對(duì)As(V的抗性。純化的PvACR2蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物在GSH等協(xié)同因子存在的條件下能在體外將A

25、s（V）還原成As（III） 23。Rathinasabapathi等也從蜈蚣草的cDNA文庫中克隆了植物磷酸丙糖異構(gòu)酶 （TPI： triosephosphagte isomerase）的同源基因 （PV4-8）。但超量表達(dá)該基因能提高As(V敏感菌株WC3110對(duì)As（V）的抗性，不能提高整個(gè)砷抗性操縱子缺失的突變體菌株AW3110對(duì)As（V）的抗性24。此外，Dong等從蜈蚣草的cDNA文庫中克隆了植絡(luò)素合成酶基因（PvPCS1），該基因編碼512個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為56.9103。在酵母體內(nèi)超量表達(dá)該基因能提高酵母對(duì)鎘的抗性25。深入研究蜈蚣草體內(nèi)砷代謝過程及相關(guān)基因和酶的功能，不僅

26、可以提高蜈蚣草吸收和富集砷的能力，而且還可利用基因工程技術(shù)來研發(fā)比蜈蚣草適用范圍更廣、栽培更容易、生物量更大的砷超富集植物，從而更好地利用植物修復(fù)技術(shù)來治理砷污染土壤。例如，在擬南芥體內(nèi)同時(shí)超量表達(dá)大腸桿菌的砷酸鹽還原酶基因（ArsC）和植絡(luò)素合成酶基因（-ECS），超量表達(dá)的植株對(duì)砷的抗性提高，在同樣含砷的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因植株的生物量是野生型的417倍26。第3章 分子生物學(xué)技術(shù)在石油污染土壤治理中的應(yīng)用石油中含有飽和烴、芳香烴、氮硫氧化物及瀝青質(zhì)等都具有毒性，多環(huán)芳烴（PAHs）、苯等還具強(qiáng)烈的“三致”（致癌、致畸、致突變）作用。石油進(jìn)入土壤會(huì)影響其正常功能，有害物質(zhì)還會(huì)通過食物鏈在動(dòng)植物

27、及人體內(nèi)富集。隨著工業(yè)化的日益發(fā)展，石油污染逐漸引起人們的重視。石油污染治理過程中，環(huán)保、高效的生物修復(fù)技術(shù)被廣泛應(yīng)用，而微生物由于代謝活性具有一定優(yōu)勢(shì)，發(fā)展?jié)摿^大。許多人對(duì)石油污染土壤中的生物多樣性及其變化進(jìn)行了研究。吳偉林等采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，從被石油烴污染多年的油泥沙和鉆井產(chǎn)生的落地原油新污染土壤中提取細(xì)菌總DNA，并對(duì)提取的基因組總DNA中16S rDNA V3可變區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增和變性梯度凝膠電泳（DGGE）測(cè)定。結(jié)果表明，年代較久的石油重度污染土壤菌群數(shù)量少于輕度污染土壤，經(jīng)人工堆肥處理的土壤生物多樣性明顯優(yōu)于未進(jìn)行人工處理的污染土壤；經(jīng)堆肥處理的土壤中微生

28、物多樣性在縱向上也存在差異，中層土微生物多樣性明顯，表層土最不明顯；不同污染土壤中存在一定數(shù)量相同的優(yōu)勢(shì)菌群，但也表現(xiàn)了相當(dāng)?shù)牟町愋裕?jīng)堆肥處理的污染土壤中微生物群落組成的相似性在縱向上也存在差異27。袁婧等從大慶油田受石油污染的土壤中分離得到特征明顯的3株石油降解細(xì)菌（分別編號(hào)為18、H和21），利用PCR技術(shù)對(duì)其16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，之后對(duì)16S rDNA進(jìn)行了全序列分析，并且綜合形態(tài)學(xué)及生理生化試驗(yàn)獲得下表結(jié)果28。 表3-1 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果和菌種名稱菌株編號(hào)全長（bp）GenBank中登錄號(hào)鑒定結(jié)果相似度（%）181417IcII 47421Licrobacterium oxy

29、dans99H1412IcII 11019Arthrobacter sp.99211442IcII 41887Bacillus sp.100Lucas等從南極土壤中篩選耐冷石油烴降解菌，通過16S rDNA鑒定分析，證明分別屬于紅球菌屬（Rhodococcus）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）29。Eriksson等通過RISA分析揭示了低溫環(huán)境和烴類污染對(duì)微生物的選擇性30，而Gerdes等通過DGGE和FISH技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，在1的低溫石油污染環(huán)境中微生物多樣性顯著下降，優(yōu)勢(shì)微生物種屬為-變形桿菌31。Eriksson等研究還發(fā)現(xiàn)，低溫環(huán)境下石油污染土壤的微生物除了數(shù)量、種群結(jié)構(gòu)發(fā)

30、生變化外，其石油烴降解生物活性也發(fā)生改變，在7和5條件下，表征微生物代謝活性的RNA/DNA指標(biāo)與烴類去除率、CO2產(chǎn)生量顯著相關(guān)30。此外，印度的Mishra等考察了基因重組菌的原油降解效果、存活能力及其穩(wěn)定性，將編碼熒光酶的Lux基因的質(zhì)粒導(dǎo)入重組菌，尤其關(guān)注質(zhì)粒丟失的情況。試驗(yàn)證明Lux-PCR擴(kuò)增插入序列是穩(wěn)定的，在-70甘油中保存一年后插入子仍具有穩(wěn)定性。利用基因工程技術(shù)，克隆最初的菲、萘、芴酮降解步驟中的基因，得到多種基因工程菌種32。Mills D K等利用Trflp和LH-PCR分子生物學(xué)技術(shù)監(jiān)控生物修復(fù)中營養(yǎng)對(duì)微生物的群落動(dòng)力學(xué)的影響，研究污染物的降解和微生物基礎(chǔ)營養(yǎng)物之間的

31、關(guān)系33。第4章 分子生物學(xué)技術(shù)在農(nóng)藥和除草劑污染土壤中的應(yīng)用趙璇等對(duì)受氯酚污染的土壤中的微生物DNA進(jìn)行了提取，并利用DGGE分析了微生物的16S rDNA譜帶，結(jié)果顯示：無論是受氯酚污染的土壤樣品，還是未受氯酚污染的土壤樣品，其微生物種群的16S rDNA的譜帶都很復(fù)雜；受氯酚污染的土壤樣品與未受氯酚污染的土壤樣品，其DNA譜帶存在明顯的差別，表明氯酚對(duì)土壤中的微生物種群結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生影響。此外，在未受氯酚污染的土壤和受氯酚污染的土壤中，存在一些共同的DNA譜帶類型，但其強(qiáng)度有所差別。同時(shí)他們還從土壤中富集分離得到對(duì)2， 4-二氯酚具有高效降解能力的微生物混合菌群，利用平板劃線法從混合微生物菌

32、群中分離出以二氯酚為唯一碳源和能源的純種微生物。利用16S rDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)該微生物為紅球菌屬（Rhodococcus）34。張倩茹等從清潔土壤和長期施用農(nóng)藥的污染土壤中提取得到微生物，并對(duì)其16S rDNA片段的DGGE指紋圖譜進(jìn)行分析分析，結(jié)果表明清潔土壤和污染土壤的生物區(qū)系具有非常明顯的差異，其中污染土壤出現(xiàn)了3條特異性帶。進(jìn)一步通過乙草胺、Cu2+單一與復(fù)合污染土壤16S rDNA片段DGGE指紋圖譜分析則表明，復(fù)合污染生態(tài)毒理效應(yīng)在分子水平上更大程度上直接取決于其存在濃度水平的組合關(guān)系。在乙草胺-Cu2+復(fù)合污染脅迫下，當(dāng)兩者濃度組合為250-300mg/L時(shí)，同樣產(chǎn)生了3條特

33、異性條帶且亮度增強(qiáng)。此外，他們還從污染土壤中篩選出可降解乙草胺的菌株524，其對(duì)乙草胺的降解率可達(dá)62%。對(duì)其16S rDNA進(jìn)行序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)它與產(chǎn)酸克雷伯菌屬（Klebsiellapneumoniae）的多株菌序列同源性為99%，初步鑒定為產(chǎn)酸克雷伯菌屬35。第5章 總結(jié)及展望相對(duì)水和大氣污染等污染類型，土壤污染具有潛伏性、隱蔽性、長期性和不可逆性等特點(diǎn)，修復(fù)難度較大。此外，土壤污染的類型多樣，包括農(nóng)藥和除草劑污染、重金屬污染和石油污染等，這就進(jìn)一步加大了土壤修復(fù)的難度。當(dāng)前，土壤污染修復(fù)的方式主要有化學(xué)沉淀固定、微生物修復(fù)和植物修復(fù)等。其中，微生物和植物的數(shù)量大、增殖生長快，而且不需要過

34、多的投入，因此微生物修復(fù)和植物修復(fù)技術(shù)越來越受到環(huán)境工作者地重視。而且，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的抗性微生物得以鑒定，越來越多的與微生物降解和轉(zhuǎn)化以及植物超富集有關(guān)的基因被發(fā)現(xiàn)，并且得到加強(qiáng)。相信分子生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，定會(huì)推動(dòng)土壤污染修復(fù)的進(jìn)程。參考文獻(xiàn)1夏家淇，駱永明. 關(guān)于土壤污染的概念和3類評(píng)價(jià)指標(biāo)的探討J. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)，2006，22（1）：87-902 劉堯，周啟星. 水、土環(huán)境污染的分子診斷與研究展望J. 環(huán)境化學(xué)，2010，29（4）3 郝亞琦，王益權(quán). 土壤污染現(xiàn)狀及修復(fù)對(duì)策J. 水土保持研究，14（3）.4楊杏芬. 環(huán)境雌激素污染與毒效應(yīng)研究的現(xiàn)狀與展望J

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