體外培養(yǎng)心臟成纖維細(xì)胞增殖的檢測(cè)方法

1、 文章編號(hào) :1000-2235(2000 01-0010-04體外培養(yǎng)心臟成纖維細(xì)胞增殖的檢測(cè)方法林嵐洪華山王一波江瓊摘要 :目的 在培養(yǎng)的心臟成纖維細(xì)胞模型上建立檢測(cè)增殖的方法 。 方法 (1 差速貼壁分離法培養(yǎng)乳鼠心臟成纖維細(xì)胞 , 用光鏡 、 電鏡及免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行鑒定 。 (2 作用下 B rdU 摻入和 W ST 21代謝活性 。 結(jié)果 (1 培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和波形蛋白 , 鑒定為成纖維 細(xì)胞 。 (2 在 0, 1%, 215%, 5%和 10%的胎牛血清作用下 , B rdU 201186±01025, 01300±01073; 01466

2、7;01049, 01531±01072; 01761±0±001±01048, 01833±01073和 01905±01064, 01935±01053(P <0101 。 (, W ST 21法 適用于該細(xì)胞的增殖 。 (2 B rdU 、 W ST 21EL DNA 合成及其代謝活性 , 是檢測(cè)細(xì) 胞增殖的新方法 。關(guān)鍵詞 :心肌 , ; ; ; ; 細(xì)胞周期 中圖分類(lèi)號(hào) :. 1; R :A收稿日期 :1999-10-22基金項(xiàng)目 :福建省科委科技基金資助課題 (99-Z -163作者單位 :福建醫(yī)科大學(xué) 附

3、屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科 , 福州 350001作者簡(jiǎn)介 :林嵐 , 女 , 1969年 9月生 , 醫(yī)師 , 醫(yī)學(xué)碩士 .近年來(lái)研究表明 , 心臟間質(zhì)細(xì)胞 (主要是成纖維 細(xì)胞 不僅具有重要的生理功能 , 而且其細(xì)胞增殖參 與了高血壓左室肥厚 、 缺血性心臟病 、 擴(kuò)張型心肌 病 、 充血性心力衰竭等許多心血管疾病的病理過(guò) 程 1。 因此 , 心臟成纖維細(xì)胞增殖的病理生理學(xué)成為 現(xiàn)代心血管疾病研究的一個(gè)熱點(diǎn) 。 檢測(cè)細(xì)胞增殖的 方法較多 , 各有利弊 2。 最直接的細(xì)胞計(jì)數(shù)法操作繁 瑣 , 細(xì)胞用量較大 ; 噻唑藍(lán) (M T T 法因其產(chǎn)生難溶 結(jié)晶物 , 測(cè)定步驟較多 , 敏感性相對(duì)較低 ; 而

4、W ST 21(a w ater 2so lub le su lfonated tetrazo lium , 即 4232(42i odop henyl 222(42n itrophenyl 22H 252tetrazo li o 21, 32benzene disu lfonate , 4232(42碘 苯 基 222(42硝苯基 22H 252四氮唑 21, 32苯磺酸鈉 是 穩(wěn)定的即用型試劑 , 其在活細(xì)胞中的代謝產(chǎn)物為水 溶性 , 具有可以與非同位素的 5 2溴脫氧尿嘧啶核苷 (52b rom o 22 2deoxyu rine , B rdU 摻入同步測(cè)定一 個(gè)細(xì)胞群體的代謝活性及其

5、 DNA 合成的優(yōu)點(diǎn) , 但 其不足之處在于 W ST 21不能被所有的細(xì)胞所代 謝 。 筆者報(bào)道 W ST 21在體外培養(yǎng)的乳鼠心臟成纖 維細(xì)胞中的代謝變化并建立以同步測(cè)定 B rdU 摻入 和 W ST 21代謝活性來(lái)檢測(cè)心臟成纖維細(xì)胞增殖的 方法 。1材料與方法1. 1細(xì)胞培養(yǎng) 3無(wú)菌條件下 , 取下 14日齡 Sp rague 2D aw ley 大鼠乳鼠 (上海醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中心提供 心室 , 浸入 D 2H ank s 液中剪碎 。用 011%胰蛋白酶 (美國(guó) D IFCO 公司 于 37水浴并在磁力 攪拌器上 (速率 100r m in 消化細(xì)胞 , 每 10m in 收 集

6、一次細(xì)胞 。將離心后所得的全部細(xì)胞用含 10%胎 牛血清 (FCS , 杭州四季清生物技術(shù)材料研究所 的 I M DM 培養(yǎng)液 (美國(guó) G I BCO 公司 充分混勻 , 一并收集于 100m l 大培養(yǎng)瓶中 , 送入 37 5%CO 2培養(yǎng) 箱 (2300型 SH EL 2LAB , 美國(guó) Sheldon 公司 中培養(yǎng) 6090m in 。 在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi) , 成纖維細(xì)胞貼壁速度較快 , 先附于瓶底 , 而心肌細(xì)胞仍存在于細(xì)胞懸液中 , 將細(xì)胞懸液倒掉 , 經(jīng)兩次差速貼壁后仍附于瓶底的 絕大 多 數(shù) 為 成 纖 維 細(xì) 胞 。 加 入 含 10%FCS 的 I M DM 培養(yǎng)液 (完全培養(yǎng)液

7、培養(yǎng)至細(xì)胞匯合 (約 23天 , 用 0115%胰蛋白酶消化傳代 (1 215 。 第 二代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn) 。1. 2細(xì)胞觀察與鑒定用倒置顯微鏡 (重慶光學(xué)儀 器廠 及透射電鏡 (H u 212A 型 , 日本日立公司 觀察細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu) 。 用即用型 SP 免疫細(xì)胞化學(xué) 方法 4, 波形蛋白單克隆抗體 (福州邁新公司 為一 抗 , 對(duì)心臟成纖維細(xì)胞進(jìn)行染色 , PB S 作陰性對(duì)照 。 1. 3實(shí)驗(yàn)細(xì)胞準(zhǔn)備與分組第二代心臟成纖維細(xì) 胞稀釋成 5×104 m l , 均勻接種在 24孔或 96孔培養(yǎng) 板上 。 待細(xì)胞生長(zhǎng)至 50%匯合時(shí) , 吸去原培養(yǎng)液 ,1D 2H ank s

8、洗滌兩次 , 用不含血清的 I M DM 培養(yǎng)液靜 止 (qu iescen t 培養(yǎng) 24h , 然后分別加入含不同濃度 FCS 的培養(yǎng)液培養(yǎng) 24h 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 。實(shí)驗(yàn)共分 5組 :無(wú)血清組 , 1%, 215%, 5%及 10%FCS 組 。 每組重復(fù) 3孔 。1. 4細(xì)胞計(jì)數(shù)生長(zhǎng)在 24孔培養(yǎng)板上的細(xì)胞經(jīng)不 同濃度血清作用 24h 后 , 用 0115%胰蛋白酶消化至 細(xì)胞分離 , 收集各孔細(xì)胞 , 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板和錐蟲(chóng)藍(lán) 染液進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù) 。1. 5同步測(cè)定細(xì)胞 B rdU 摻入和 W ST 21代謝活 性 。1. 5. 1實(shí)驗(yàn)試劑試劑盒購(gòu)自德國(guó) BoehM annhei m 公司

9、 。100m o l L B rdU 培 養(yǎng)液以 1 10010B rdU 標(biāo)記溶劑 (無(wú)菌水劑 , 100m o l L 。A n ti 2B rdU 2POD 抗體工作液用雙蒸水 111 m l 溶解 A n ti 2B rdU 2POD 粉劑 10m in , 充分混勻制 成抗體儲(chǔ)存液 , -20存放 。 實(shí)驗(yàn)時(shí)用試劑盒提供的 抗體稀釋液將儲(chǔ)存液稀釋 100倍 , 即為抗體工作液 (即配即用 。PB S 洗滌液用雙蒸水將試劑盒提供的 10×PB S 儲(chǔ)存液稀釋 10倍 。1. 5. 2對(duì)照孔設(shè)置每次實(shí)驗(yàn)均設(shè) 2個(gè)空白對(duì)照 孔 (以 I M DM 培養(yǎng)液代替細(xì)胞 和 1個(gè) B r

10、dU 背景 對(duì) 照孔 (含細(xì)胞 , 但不加 B rdU 標(biāo)記液 , 余步驟不 變 , 上述對(duì)照孔吸光值均應(yīng) <011。1. 5. 3實(shí)驗(yàn)步驟在 96孔板上生長(zhǎng)的細(xì)胞經(jīng)不同 濃度的血清作用 24h 后 , 加入無(wú)菌 100m o l L B rdU 標(biāo)記液 10l 孔 (終濃度為 10m o l L , 置培 養(yǎng)箱孵育 9h , 加入即用型 W ST 21溶液 10l 孔 , 繼 續(xù)孵育 3h 。取出培養(yǎng)板 , 置振蕩器上充分振蕩 (300 r m in 1m in , 在酶標(biāo)儀 (B i o 2RAD 型 550, 日本伯樂(lè) 公司 450 655nm 雙波長(zhǎng)處檢測(cè) OD 值 , 即 W

11、ST 21檢測(cè) 值 。 充 分 傾 出 原 培 養(yǎng) 板 各 孔 內(nèi) 液 體 , 加 入 F ixD enat 液 200l 孔 (使細(xì)胞固定 , DNA 變性 , 室 溫下 (1825 孵育 30m in , 充分傾出 F ixD enat 液 , 加入 A n ti 2B rdU 2POD 工作液 100l 孔 , 室溫下 孵育 90m in 。 傾出上清液 , 加入 PB S 洗滌液 300l 孔 , 洗 3×5m in , 傾出洗滌液 , 加入即用型底液 100l 孔 , 室溫下孵育至顯色充分 (約 20m in 。 加入 1 m o l L H 2SO 425l 孔終止反應(yīng)

12、, 置振蕩器上充分 振蕩 (300r m in 1m in , 立即在酶標(biāo)儀 450 655nm 雙波長(zhǎng)處檢測(cè) OD 值 (在加入終止液 5m in 內(nèi)完成 檢測(cè) , 即 B rdU 檢測(cè)值 。 每份樣本檢測(cè) 2次 (分別用 不同的空白對(duì)照孔調(diào)零 , 取平均值 。1. 6數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (x -±s 表示 , 用 SPSS 軟件包 O ne 2W ay ANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 學(xué)處理 。2結(jié)果2. 1, , 23天 , , 有的交叉重疊生長(zhǎng) 。 , 心臟成纖維細(xì)胞呈梭形 , 胞體較 ; 細(xì)胞核較大 , 呈橢圓形 , 通常含 23個(gè)核 , 無(wú)自發(fā)性搏動(dòng) 。透射電

13、鏡下見(jiàn)心臟成纖維細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有豐富的 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng) , 未見(jiàn)肌原纖維 ; 細(xì)胞核大 , 可見(jiàn) 2個(gè)以 上細(xì)胞核 , 核仁明顯 , 有的可見(jiàn)雙核仁 。 細(xì)胞表面有 許多短小突起 , 局部細(xì)胞間隙中可見(jiàn)膠原纖維 , 未見(jiàn) 細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu) (圖 1 。圖 1 心臟成纖維細(xì)胞細(xì)胞表面見(jiàn)膠原纖維 (A , B , 無(wú)肌原纖維和細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu) . ×9000(A 為右下角局部放大 SP 免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示 , 心臟成纖維細(xì)胞波 形蛋白呈陽(yáng)性反應(yīng) , 即胞漿內(nèi)圍繞細(xì)胞呈紅色絲狀 網(wǎng)絡(luò)形態(tài) , 陽(yáng)性率在 95%以上 (圖 2 ; PB S 對(duì)照呈 陰性 。2. 2不同濃度 FCS 對(duì)心臟成纖維細(xì)胞數(shù)量

14、的影響 隨著 FCS 濃度的逐漸增加 , 心臟成纖維細(xì)胞數(shù)量 增加 (圖 3 。 在 0, 1%, 215%, 5%和 10%FCS 作用 下 , 心臟成纖維細(xì)胞活細(xì)胞數(shù) (×104 孔 分別為 8184±0190, 9162±0163, 11131±0197, 12128±0198和 13185±0169, 二者呈明顯量效關(guān)系 (P < 0105或 0101 。11 圖 3 不同濃度 FCS 對(duì)心臟成纖維細(xì)胞數(shù)量的影響2. 3不同濃度 FCS 對(duì)心臟成纖維細(xì)胞 B rdU 摻入和 W ST 21代謝活性的影響不同濃度 FCS

15、臟 成纖維細(xì)胞 B rdU (0101 , 附表 不同濃度 B rdU 摻入與代謝活性的影響FCS (%B rdU W ST 21 001186±0102501300±01073101466±01049301716±010643#501834±010483 01833±010733 1001905±01064301935±010533 n =81與 0%FCS 組比較 , 3:P <0101; 與 1%FCS 組比較 , #:P <0101; 與 215%FCS 組比較 , :P <0101; 與

16、 5%FCS 組比較 , :P <0101 .圖 4 不 同 濃 度 FCS 對(duì) 心 臟 成 纖 維 細(xì) 胞 B rdU 摻 入 和W ST 21代謝活性的影響 :B rdU ; :W ST 21.3討論心臟成纖維細(xì)胞的增殖及其胞外基質(zhì)的堆積 , 在心肌肥厚等許多心血管疾病的病理過(guò)程中起重要 作用 。 本組實(shí)驗(yàn)用反復(fù)差速貼壁方法培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng) 形態(tài)學(xué)觀察和波形蛋白 SP 染色 , 鑒定為心臟成纖 維細(xì)胞 , 為進(jìn)一步的增殖動(dòng)力學(xué)研究提供了基礎(chǔ)條件 。反映細(xì)胞增殖狀況的指標(biāo)有活細(xì)胞數(shù)量 、 DNA合成 、 細(xì)胞代謝活性和細(xì)胞周期等 , 其中最直接的指 標(biāo)是活細(xì)胞數(shù)量的變化 。 但細(xì)胞直接計(jì)數(shù)

17、法操作繁 瑣費(fèi)時(shí) , 所需細(xì)胞量較多 。 四唑鹽 M T T 、 XT T (2,32b is (22m ethoxy 242n itro 252su lfop henyl 252(phenylam inocarbonyl 22H 2tetrazo lium hydrox ide 及 W ST 21 產(chǎn)物 (fo r azan 。 與 T 法相比 , , 具 方便 、 省時(shí) (僅需 0154h 的優(yōu)點(diǎn) ; 而ST 21又比 XT T 穩(wěn)定 , 可作即用型試劑 。 近年來(lái)國(guó) 外學(xué)者采用 W ST 21方法定量測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞的活性與增殖能力 , 證實(shí)了其方法的可靠性和簡(jiǎn)易性 5, 6。 W ST 2

18、1的局限在于不能被所有細(xì)胞所代謝 。 筆者的 研究結(jié)果表明 , 隨著血清濃度增高 , 乳鼠心臟成纖維細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)量增加 , 其 W ST 21代謝活性亦升高 , 說(shuō)明心臟成纖維細(xì)胞可對(duì) W ST 21進(jìn)行代謝 , 因此 適用于該細(xì)胞的增殖研究 。DNA 合成是細(xì)胞增殖的先決條件 7, 細(xì)胞增殖時(shí) , DNA 合成增加 , 活細(xì)胞數(shù)目增多 , 代謝活性亦升 高 。但是 DNA 合成增加并不一定意味著細(xì)胞增殖 , 相 反 地 , 有 時(shí) 卻 是 細(xì) 胞 凋 亡 的 先 兆 。 如 K irshenbaum8、 L iu 9等的研究表明 , 腺病毒 E 1A在誘導(dǎo)成年心肌細(xì)胞凋亡的同時(shí)卻促進(jìn)其 DN

19、A 合 成 ; W agner 5等的研究亦發(fā)現(xiàn) , 低濃度的幽門(mén)螺桿 菌能使胃上皮細(xì)胞數(shù)目減少 , 但其 DNA 合成增加 。 此外 , 放線菌素 D 可抑制細(xì)胞 DNA 合成 , 但并不影 響細(xì)胞代謝活性 10, 可見(jiàn)細(xì)胞 DNA 合成與代謝活性并不總是呈平行關(guān)系 。 因此 , 對(duì)同一細(xì)胞群體同步 測(cè)定其代謝活性與 DNA 合成 , 能比較真實(shí)全面地 反映細(xì)胞的增殖動(dòng)力學(xué)變化 , 在研究某種因子或藥 物促進(jìn) DNA 合成卻誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 , 或者抑制 DNA 合成而不影響其代謝活性的作用時(shí)尤具有特殊意 義 。 目前在對(duì)心臟成纖維細(xì)胞的增殖動(dòng)力學(xué)研究中 , 尚未見(jiàn)同步測(cè)定細(xì)胞代謝活性和 DNA

20、 合成的報(bào) 道 。 筆者結(jié)合 W ST 21檢測(cè)和 B rdU 摻入 (后者被公 認(rèn)為非同位素的反映細(xì)胞 DNA 合成的主要方法 的特點(diǎn) , 用 EL ISA 法同步測(cè)定乳鼠心臟成纖維細(xì)胞 的代謝活性和 DNA 合成以反映細(xì)胞的增殖狀態(tài) , 獲得成功 。 結(jié)果顯示 , 隨著血清濃度的逐漸增加 , 心 臟成纖維細(xì)胞的 W ST 21代謝活性及其 B rdU 摻入21(即 DNA 合成 同步增加 , 證實(shí)胎牛血清對(duì)心臟成 纖維細(xì)胞具有顯著促增殖作用 , 這與細(xì)胞直接計(jì)數(shù) 的結(jié)果相符 。此外 , B rdU 、 W ST 21EL ISA 在微量滴 定板上實(shí)驗(yàn) , 方法快速方便 , 并可減少細(xì)胞數(shù)量

21、 , 適 用于多樣本的研究 。筆者認(rèn)為 , W ST 21能在活的心臟成纖維細(xì)胞中 進(jìn)行代謝 , 適用于該細(xì)胞的增殖研究 。 B rdU 、 W ST 21 EL ISA 同步測(cè)定心臟成纖維細(xì)胞的 DNA 合成及其 代謝活性以反映細(xì)胞的增殖狀態(tài) , 具有結(jié)果真實(shí)可 靠 、 方法敏感快速 、 無(wú)放射毒性等優(yōu)點(diǎn) , 為在體外培 養(yǎng)的細(xì)胞模型上進(jìn)行心臟各種病理過(guò)程的研究提供 了測(cè)定細(xì)胞增殖的新方法 。 (圖 2參考文獻(xiàn) :1 W eber KT . health and disease :T he fibrillar co llagen J . J CC , 1989; 13(7 :1637 2江謙

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30、1%, 215%, 5%and 10%FCS , the ab so rbance spectra (op tical den sity of B rdU inco rpo rati on and W ST 21cleavage p roducts on the cu ltu red cardiac fib rob lasts w ere fo llow ing respectively :01186±01025, 01300±01073; 01466±01049, 01531±01072; 0176±01039, 01716±01064; 01834&