復(fù)雜樣品的分離分析

1、一 復(fù)雜樣品的分離分析引言：隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進步，尤其是分子生物學(xué)和計算機的推動，當前分析科學(xué)取得長足的進步，各種新的分析儀器和方法無論在適用性和靈敏度方面都有很大的發(fā)展過去需要幾年才能測定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，現(xiàn)在幾個小時就可以迅速測定，人類基因圖譜的完全測定曙光已在眼前。采用高效毛細管色譜(包括毛細管電泳)很快分離上百個成分已不是困難的事，色譜和各種結(jié)構(gòu)測定手段的在線聯(lián)用，使得無論對已知化合物的在線監(jiān)測，還是對未知混合物的分析能力都大為增強。目前分析化學(xué)正在生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、材料科學(xué)、藥物學(xué)等前沿領(lǐng)域發(fā)揮極大的推動作用但是隨著這些學(xué)科的不斷發(fā)展，分析樣品正變得越來越復(fù)雜。分析任務(wù)也變得越來越艱

2、巨進入21世紀，人們將逐漸告別單一組成的分析，越來越多地面臨復(fù)雜樣品的分離分析，組成一結(jié)構(gòu)一功能將是人們關(guān)心的焦點，復(fù)雜樣品將是擺在人們面前的分析難題一復(fù)雜樣品分析的基本思路復(fù)雜樣品是指組分種類多、含量差別大、已知信息少幾乎為一黑箱的復(fù)雜混合物。這樣的樣品在生物、環(huán)境、材料中占大多數(shù)例如中藥提取物或環(huán)境污染物來源于自然界，常常含有從無機到有機、從離子性、強極性到非極性、從小分子到大分子、從位置異構(gòu)體到對映體、從常量到痕量的上百種成分，而且這些成分大都是未知的即使是曾被發(fā)現(xiàn)的成分，也很難獲得純品或?qū)φ掌?，與大量未知物混于一體，無異于未知化食物。復(fù)雜樣品的分析，首先需要弄清組成這一樣品體系的各種組

3、成及其比例關(guān)系，了解組成這一體系的基本組分分布，在此基礎(chǔ)上，還需對每一組成進行詳細了解，如結(jié)構(gòu)確定，為最終闡明組成一結(jié)構(gòu)一功能提供依據(jù)(或根據(jù)組成一功能關(guān)系先確定有效組成，再確定這些有效組成的結(jié)構(gòu))因此，對復(fù)雜樣品的分離分析，可按三個層次進行研究：(1)利用高效色譜進行復(fù)雜混合物的系統(tǒng)分離分析，獲得基本組成色譜峰及其比例關(guān)系：(2)混合物組成成分的結(jié)構(gòu)鑒定，這包括離線各種光譜、質(zhì)譜的綜合鑒定及色譜和各種技術(shù)的在線聯(lián)用，尤其是聯(lián)用技術(shù)不僅可以進行快速簽定，而且由于減少了處理步驟，避免了處理過程造成的組分損失，因此具有更高的定量可靠性，對含量少的組分也可以進行定性(這些含量少的組分是比較難于得到純

4、品的)；(3)盡管高效色譜和各種光譜、質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)可以極大地促進復(fù)雜混合物的分析，但應(yīng)該看到聯(lián)用技術(shù)般要求色譜能分離獲得純色譜峰，才能較好地獲得其光譜、質(zhì)譜，進行較好的分析由于樣品組分復(fù)雜，在實際分離中即使采用多柱系統(tǒng)在最優(yōu)化條件下，仍會有大量的不同程度重疊峰，因此，利用先進的算法和計算機，結(jié)合色譜和各種光譜、質(zhì)譜規(guī)律，進行多維分析信號與信息的綜合處理，解決重疊峰的解析和定性、定量，最終完成復(fù)雜樣品的分析任務(wù)二復(fù)雜樣品組成的多模式多柱色譜及聯(lián)用技術(shù)的綜合分離分析對于復(fù)雜樣品的分析，盡管現(xiàn)代高效色譜拄具有很高的柱效，借助于計算機模擬、優(yōu)化可獲得極佳的分離效果，但由于樣品幾乎包含各類化合物離子性

5、、強極性、中等極性、弱極性、對映體、揮發(fā)油類、大分子、金屬離子和微量元素等，解決此類復(fù)雜體系的分離分析，仍需要發(fā)展智能多模式多柱系統(tǒng)(1MMlCC)以及色譜與其它技術(shù)的聯(lián)用這是因為對于不同的色譜模式各有其內(nèi)在的優(yōu)點，它們各自都有解決特定分離問題的優(yōu)勢因此利用不同色譜模式、不同柱子的特性和優(yōu)勢，取長補短，可以利用不同柱子對樣品組分的選擇性、互補性來達到單模式、單柱子色譜系統(tǒng)所不能解決的分離問題 智能多模式多柱系統(tǒng)及其聯(lián)用技術(shù)包括高效液相色譜(服LC)、氣相色譜(GC)、毛細管電泳(CE)和各種聯(lián)用技術(shù)等眾多于段，它利用計算機技術(shù)并結(jié)合了色譜專家的知識和經(jīng)驗，是智能的、統(tǒng)一的分析方法1 對一些極性

6、有機溶劑提取物可以綜合考慮不同液相色譜方法進行分離分析 通常對于未知復(fù)雜混合物的分析，首先采用合適的溶劑進行溶解或提取其中成分進行分離分析研究根據(jù)樣品不同性質(zhì)可以來用不同極性的溶劑進行溶解和多步提取，獲得其一種或多種樣品成分 對于所獲得的組分，應(yīng)盡量進行簡單的處理，減少成分損失利用簡單濃縮，然后過濾宣接利用色譜進行分離分析，充分發(fā)展色譜方法，進行復(fù)雜混合物的分離分析不失為一種高效的方法對于未知的復(fù)雜樣品提取物，可以根據(jù)提取溶劑進行方法的初步發(fā)展對于極性溶劑提取物一般可以利用目前應(yīng)用比較成熟的反相液相色譜進行分離柱子選擇以Cls柱為主，根據(jù)分離情況可以進行不同C18柱及C8柱及苯基拄組成多柱系統(tǒng)

7、進行互補分離一般Q s填料裝填好，技效高，適用性廣，與其它填料相比，Qs填料對各類樣品均有較強的適應(yīng)能力，因此可以以q8柱作為第一柱從色譜填料的發(fā)展來看，采用少含金屬離子高純硅膠基質(zhì)作原料，鍵合相均勻，封尾好，殘余硅經(jīng)基少，碳含量高(16)是目前校子發(fā)展的主要方向另外，細管徑、細粒徑填料(如3仰)可以獲得更高的拄效，具有更強的分離能力，這些都十分有利于復(fù)雜樣品的分離分析在柱子確定之后，流動相的選擇是影響分離的最為重要的因素，流動相選擇的目的是使所有組分流得出、分得開、分析時間最短甲醇冰體系以其選擇性好價格便宜，應(yīng)用最為廣泛，可以作為未知化合物分離時選擇流動相的第一選擇除此之外，可以選擇乙臘休、

8、四氫映喃冰進行互補分離，并可采用異丙醇P醇分離部分強保留成分，所有這些流動相可以組成多二元流動相進行互補分離對于用純水溶解或提取的樣品常常含有強極性、離子性化合物，對于這些化合物的分離分析*在常規(guī)反相色譜中會幾乎不保留，因而沒有分離效果對于這些成分的分析應(yīng)考慮調(diào)節(jié)流動相的pH值、利用反相離子對色譜進行分離分板比較常用的方法是控制pH值在酸性范圍(pH值25)，并利用十二烷基磺酸鈉、庚烷磺酸鈉等進行方法初步發(fā)展，根據(jù)實驗結(jié)果進行相應(yīng)調(diào)整或多種途徑互補分離2對于有一定揮發(fā)性的化臺物應(yīng)優(yōu)先采用氣相色譜進行分離與液相色譜相比較，氣相色譜具有快速、準確、分離效率高、檢測靈敏度高，一次測定能得到多種組分的

9、定量結(jié)果等眾多優(yōu)點，因此對子有一定揮發(fā)性的樣品應(yīng)盡量利用氣相色譜進行分離分析對于非極性溶劑(如石油醚)提取物，主要以非極性化臺物為主，可以利用氣相色譜進行分離分板并且可以首先選擇一根非極性的柱子(如DB1)進行分離然后選用極性稍有差別的弱極性柱(如皿5)作為第二根柱進行雙柱分離，甚至再選一根極性住進行非常復(fù)雜混合物的多柱互補分離在每一根柱子上都需要選擇最佳的分離條件充分發(fā)揮其柱效，并實現(xiàn)互補分離3毛細管電泳應(yīng)作為液相色譜補充和發(fā)展毛細管電泳，又叫高效毛細管電泳(比)(五)，是近年來發(fā)展最快的分板方法之一毛紉管電泳是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微住分離相結(jié)合的產(chǎn)物，其優(yōu)點可概括為三高二少，即高靈敏度、高分

10、辨率、高速度、進樣少、溶劑用量少與液相色譜類似毛細管電泳也有多種操作模式，即毛細管區(qū)帶電泳(CZL)、膠柬電動毛細管色譜(M蓖CC)、毛紉管凝膠電泳(cGE)、毛細管等電聚焦(C12F)、毛細管等速電泳(CIEF)及毛細管電色譜(LKL)目前，毛細管電泳在生命科學(xué)中已廣為利用，但隨著膠束電動毛細瞥色譜、毛細瞥電色譜等技術(shù)的迅速發(fā)展，毛細管電泳在有機物的分折應(yīng)用也正逐漸展開將毛細管電泳與液相色譜結(jié)合的新型色譜技術(shù)毛細管電色譜具有液相色譜的分離機理，但由于其采用電場驅(qū)動流動相代替壓力驅(qū)動流動相，在很大程度上消除導(dǎo)致柱效降低的擴散因素，因此具有更高的柱效，目前這一研究正以極快的速度迅速發(fā)展毛細管電泳

11、將以其超強分離能力及樣品和溶劑消耗低等優(yōu)點，在復(fù)雜樣品的分折中扮演越來越重要的角色4色譜和其它結(jié)構(gòu)測定技術(shù)的聯(lián)用是解決復(fù)雜樣品分板的強有力的手段色譜的優(yōu)勢在于分離，在常規(guī)的紫外檢測器上對于無紫外吸收化合物的檢測和大量未知化合物的定性分析還須依賴于其它分板手段色譜和質(zhì)諳的聯(lián)用是目前最受重視的手段，除傳統(tǒng)的氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(G()MS)外進入90年代液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LCMS)的發(fā)展最為引人注目這是因為比MS不完全同于GGMS*其M5應(yīng)是軟的多級質(zhì)譜(MSI) 而90年代發(fā)展的大氣壓下的液相色譜和質(zhì)譜的聯(lián)用接口電噴霧接口(踢1)和大氣壓下化學(xué)電離接口(APCI)正是兩種軟電離的接口，并且在很大程度

12、上解決了使用LCMS時對液相色譜流動相的限制(如對純水和流速的限制)靈敏度也得到很大提高采用軟電離技術(shù)主要產(chǎn)生的是“擬”分：嚴離子峰，進一步使用多級質(zhì)譜，可以很好地對未知化合物的結(jié)構(gòu)進行研究利用MsM5進行選擇反應(yīng)臨測(sRM)，則具有很高的選擇性，因而具有很好的定量靈敏度和可靠性目前這一技術(shù)也成為發(fā)達國家藥物質(zhì)控的熱門手段 除液相色譜和四級桿質(zhì)譜的聯(lián)用之外，利用大氣壓下的接口，液相色譜、毛細管電泳和最新發(fā)展的正交飛行時間質(zhì)譜和離子陜質(zhì)譜也實現(xiàn)了成功聯(lián)用不僅如此，相比較基質(zhì)輔助飛行時間質(zhì)諾，基于電噴霧接口的液相色譜正交飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(如L(汀，隊QTof)不僅能對色譜流出組分進行高靈敏度檢測

13、，而且能進行準確的分子量測定，從而可能宜接給出化合物的分子式液相色譜離子阱質(zhì)譜聯(lián)用(如LQ)可以容易地進行多級質(zhì)諾測定，從而確定其分子量和相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息因此，液相色譜和質(zhì)譜的成功聯(lián)用不僅對以解決色譜難于解決的化合物的定性問題，而且也將為質(zhì)諾的分析提供極大的方便和靈活性，為質(zhì)諾提供更加廣闊的應(yīng)用前景，為復(fù)雜樣品的分析提供強有力的手段色譜和各種質(zhì)譜、核磁共振等定性手段的聯(lián)用是當前儀器分析的重要發(fā)展，除色質(zhì)聯(lián)用外，氣相色譜和紅外光譜(GC-FTIR)、液相色譜和核磁共振也實現(xiàn)了聯(lián)用(LC-NMR)液扣色譜核磁共振質(zhì)諾聯(lián)用儀(比NMRMS)也已應(yīng)用于研究中復(fù)雜樣品多模式色譜及其聯(lián)用技術(shù)綜合分析的流程如

14、下： 圖1 復(fù)雜樣品多模式多綜合分析流程圖三復(fù)雜樣品分析的理論基礎(chǔ)對于復(fù)雜的未知樣品，除了充分利用先進的儀器，采用多模式色譜及其聯(lián)用技術(shù)進行綜合分析外，還與發(fā)展與之相關(guān)的色譜分離、定性及重疊諾峰的解析方法等，進行充分的理論基礎(chǔ)研究1色譜方法發(fā)展及優(yōu)化色譜方法發(fā)展及優(yōu)化指的是對于復(fù)雜未知樣品先初步確定其基本分離條件(如模式、柱子、流動相等)，然后對此方法進行優(yōu)化，如流動相的多臺階多二元的智能優(yōu)化從而使得在繪定的柱系統(tǒng)和最佳的流動相梯度下，樣品組分獲得較好的分離，分橋時間最短，同時色譜峰高增加，檢測靈敏度也相應(yīng)地得到提高對于未知樣品的優(yōu)化策略是將未知樣品轉(zhuǎn)化為已知樣品，弄清樣品組分的保留值規(guī)律，從

15、而利用計算機進行智能優(yōu)化即通過跟蹤不同條件下色譜峰流出次序，同時獲得各組分的保留值及峰形參數(shù)，進一步利用這些參數(shù)通過保留值方程和峰形變化規(guī)律，采用計算機進行分離條件的選擇和模擬實驗，獲得其最佳分離條件未知樣品轉(zhuǎn)化為已知樣品的關(guān)鍵是如何獲取組分的保留值方程早在80年代，盧佩章提出，針對不同的最難分離物質(zhì)對，應(yīng)采用多階梯度進行優(yōu)化的思想張樣明將這一思想用于環(huán)境樣品中大氣毒物的人工干預(yù)智能優(yōu)化，取得了很好的效果呂美玲結(jié)合多二元流動相和臺階梯度的優(yōu)點，提出多臺階多二元智能優(yōu)化的設(shè)計思想，并用于多環(huán)芳烴的分離，取得較好的效果 采用多臺階多二元的智能優(yōu)化方法，一方面可以擴大流動相的范圍(選擇性和沖洗強度)

16、，滿足分離要求，另一方面優(yōu)化針對性強，容易難確找到最優(yōu)點，而且實現(xiàn)簡便因此，多臺階多二元的優(yōu)化策略為復(fù)雜體系的優(yōu)化開辟了新天地在環(huán)境污染物多氯聯(lián)苯(P帕)和中藥黃茂分析中，兩個優(yōu)化結(jié)果如圖2及3所示t（min）圖-2多氯聯(lián)苯（PCB）的分析 tR(min) 圖3 中藥黃氏的分析 柱子：Spherisorb LC-18（5m）；流動相：從純水，甲醇/水到70異丙醇甲醇的多臺階雙二元流動相梯度洗脫；流速：1ml/min；檢測：200-400(UV)每秒一次PDA紫外掃描，并于203nm下提取色譜圖。2多維聯(lián)合定性復(fù)雜樣品的分析結(jié)果是一個巨大的多維信息庫，其中包括色譜、質(zhì)諧和光譜方面的大量信息需要采

17、用多維數(shù)據(jù)處理的方法和理論對大量數(shù)據(jù)進行處理，進行多維聯(lián)合定性，并且采用不斷發(fā)展的計算機技術(shù)和化學(xué)計量學(xué)手段，通過對大量信息的提取、加工，形成統(tǒng)一的數(shù)據(jù)庫盡管色譜定性相對不足，但利用氣相色譜的Kvoat指數(shù)和液相色譜的a, c指數(shù)定性再結(jié)合其它定性手段還是有一定特色的 例如盡管色譜聯(lián)用時質(zhì)諾在很大程度上解決色諾定性上的不足，但質(zhì)譜很難對異構(gòu)體則進行定性；相反，有些異構(gòu)體很容易被色譜分離，因此，聯(lián)合定性可以很好地解決這一問題另外，液相色譜和光電二極管陣列紫外掃描撿測器的聯(lián)用已成為一種很常用的儀器，色譜和紫外單獨定性較差，但二者的聯(lián)合定性可以提高其可靠性通過預(yù)測保留范圍后再匹配光譜或質(zhì)譜可以大大縮

18、小匹配范圍，從而增加定性的可靠性3重疊譜圖的解析及色譜置疊峰的擬合定量復(fù)雜樣品，由于其組成極其復(fù)雜，組分間的交叉重疊會十分嚴重：一方面，要進行操作條件的優(yōu)化，使組分獲得盡可能的分離；另一方面，還應(yīng)認識到，對于復(fù)雜樣品的分離分析，即使在優(yōu)化的條件下，色譜峰的重量還是不可避免的因此，發(fā)展計算機擬合技術(shù)進行重疊譜峰的解析是十分必要的例如，對于中藥提取物，包含不同種類、異構(gòu)體等多種化合物，其色譜峰必然會發(fā)生嚴重的交叉重疊，因此，中藥的色譜分析面臨的是大量重疊峰的定性、定量對于重疊譜的解析，一方面要充分利用化學(xué)計量學(xué)的方法進行色譜、光譜解析，發(fā)展各種譜的綜合解析方法，另一方面，還要更深入地認識色譜峰形規(guī)律、質(zhì)譜規(guī)律等譜學(xué)規(guī)律，利用規(guī)律解決問題目前基于色譜動力學(xué)所進行色譜峰形預(yù)測和重疊峰的解析已可以很好地擬音色譜峰，但這一規(guī)律還需進步結(jié)合質(zhì)譜等譜學(xué)規(guī)律，共同解析重疊譜，以獲取重疊組分準確的定量面積四在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用 影響中醫(yī)藥學(xué)的應(yīng)用和發(fā)展、尤其是中醫(yī)藥進入國際市場的極為重要的因素是中藥的質(zhì)量問題目前所用的質(zhì)量控制方法只測定少數(shù)成分來控制中藥質(zhì)量，由于中藥發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)是中藥的有效成分，而一味中藥中的有效成分可能是幾種成分，也可能是幾十種成分甚至更多因而目前中藥的質(zhì)量評價和質(zhì)量控制尚缺乏可靠、合理、有效